Aquí hemos proporcionado un protocolo para medir el contenido no hemo en tejidos animales. Utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. El ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina no requiere habilidades sofisticadas ni equipos altamente costosos y se puede adaptar al formato de microplaca para un mayor rendimiento de la muestra y rentabilidad.
Este protocolo es adecuado para detectar alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecargas de hierro o eficiencia del hierro. Comience cortando una muestra de tejido que pese de 10 a 100 gramos con una cuchilla de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica sobre un pequeño trozo de parafilm.
Use pinzas de plástico para colocar el pedazo de tejido en una placa de 24 pocillos. Déjelo secar en una incubadora estándar a 65 grados centígrados durante 48 horas. Alternativamente, coloque el pedazo de tejido con pinzas de palo en una taza de teflón sin hierro y séquelo en el horno de digestión por microondas del laboratorio.
Coloque cada pieza seca de tejido sobre una pequeña pieza de paraforma dentro de una balanza analítica y pésela con precisión. Transfiera cada pieza seca de tejido a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Agregue una luz de la mezcla ácida al tubo y ciérrelo.
Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que el tejido se omite aquí. Incubar los tubos a 65 grados centígrados durante 20 horas para digerir el tejido. Después de enfriar a temperatura ambiente, use una micro pipeta equipada con puntas de plástico para transferir 500 microlitros del extracto de ácido transparente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Prepare las reacciones de cromógeno directamente en las microplacas de poliestireno transparentes sin tratar de fondo plano de 96 pocillos. Incubado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mida la absorbancia de la muestra en un lector de placas a una longitud de onda de 535 nanómetros contra una referencia de agua desionizada.
La determinación del hierro no hemo mediante los ensayos colorimétricos basados en cubeta y microplacas de 96 pocillos se muestran aquí. La correlación entre los niveles de hierro no hemo a base de cubeta y basado en microplacas en 55 muestras de tejido de seis meses de edad macho negro, seis ratones, incluyendo hígado, bazo, corazón, pulmones y médula ósea se muestran aquí. La alta correlación entre las dos metodologías indica que el método basado en microplacas es una alternativa válida al método original basado en cubetas.
Finalmente, los niveles de hierro no hemo se cuantificaron con el método basado en microplacas después de la digestión ácida de la muestra derivada de los mismos tejidos con una mezcla de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético o ácido clorhídrico solo. La alta correlación muestra que el ácido tricloroacético puede ser emitido por la digestión ácida. La imagen representativa muestra los niveles de hierro no hemo en el hígado, el bazo, el corazón y el páncreas de ratones machos negros de seis tipos salvajes y ratones machos de hepcidina knockout en fondo genético de seis negros medidos con el ensayo colorimétrico basado en batofenolantrolina.
La interrupción de la hepcidina conduce a una hemocromatosis como el fenotipo de deposición de hierro con acumulación severa de hierro hepático, pancreático y cardíaco y agotamiento esplénico de hierro. Aquí se muestran los niveles hepáticos de hierro no hemo en lubina europea hembra juvenil después de la modulación experimental del hierro. Los niveles de hierro hepático aumentaron masivamente en animales tratados con hierro.
Mientras que la anemia causó una reducción leve en las reservas hepáticas de hierro. Las imágenes representativas muestran los niveles de hierro no hemo en Drosophila de un mes de edad medidos con un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina. Los resultados muestran el contenido de hierro no hemo en cada grupo de 20 moscas o el contenido estimado de hierro de cada mosca.
Considerando un peso promedio de 0.64 miligramos por mosca. Al intentar este procedimiento, recuerde limpiar a fondo todo el desgaste del vidrio y no permita que los materiales metálicos de laboratorio entren en contacto con ningún reactivo o solución debido al riesgo de contaminación.
