एक्सोनल ट्रांसपोर्ट के इन विवो इमेजिंग के लिए टूलकिट का विस्तार करना

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम लाइव एनेस्थेटाइज्ड चूहों के मोटर और संवेदी न्यूरॉन्स से अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया की गतिशीलता की कल्पना और मात्रात्मक रूप से आकलन कर सकते हैं। यह विधि जिसका उपयोग विवो में अक्षतंतु के बेसल शरीर विज्ञान को समझने के लिए किया जा सकता है और रोग के माउस मॉडल में परिधीय न्यूरोडीजेनेरेशन को चलाने वाले महत्वपूर्ण पैथो-तंत्र को प्रकट करता है। हमारी तकनीक का उपयोग जीवित मोटर और संवेदी न्यूरॉन्स में अक्षीय परिवहन पर औषधीय एजेंटों और जीन उपचार जैसे संभावित उपचारों के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

इस तकनीक का उपयोग एक विशिष्ट परिधीय तंत्रिका अक्षतंतु में विभिन्न ऑर्गेनेल को एक साथ चित्रित करने और मोटर रोग मॉडल के साथ-साथ उम्र बढ़ने के अध्ययन को रिले करने के लिए किया जा सकता है। छोटी मांसपेशियों में इष्टतम इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक वर्गीकृत ग्लास माइक्रोपिपेट खींचकर तैयारी शुरू करें। सर्जरी के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस और स्थिति के लिए सेट गर्मी चटाई पर एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप सुरक्षित करें और ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।

फिर, पांडुलिपि में वर्णित सभी आवश्यक सर्जिकल उपकरण और उपकरणों को अनपैक करें। जब तैयारी की जाती है, तो सर्जिकल स्पेस के एक अलग क्षेत्र में स्थित मुखपत्र में संवेदनाहारी माउस को स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि सर्जिकल क्षेत्र से फर शेविंग से पहले कॉर्नियल और पेडल निकासी सजगता दोनों अनुपस्थित हैं। फिर, सर्जिकल टेप के चिपचिपा पक्ष का उपयोग करके माउस से मुंडा फर को हटा दें।

अगला, पूर्व सर्जिकल वजन रिकॉर्ड करने के लिए तराजू वजन पर माउस रखें। फिर, आंख स्नेहक लागू करने और सर्जिकल क्षेत्र में माउस और मुखपत्र को स्थानांतरित करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें। टिबियलिस पूर्वकाल, या टीए मांसपेशियों को इंजेक्ट करने के लिए, माउस को पीठ पर रखें और मिडलाइन से 10 डिग्री पर हिंद अंग को फैलाएं।

जब हिंद अंग सही स्थिति में हो, तो पैर के पार एक सर्जिकल टेप रखें। 70% इथेनॉल या समकक्ष समाधान का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र को निष्फल करें। टेटनस, न्यूरोटॉक्सिन या एचसीटी समाधान के काम करने वाले एटॉक्सिक टुकड़े को एक खींचे गए ग्लास माइक्रोपिपेट में खींचें।

अगला, मोटर और प्लेट क्षेत्रों से मेल खाने वाले क्षेत्र में रुचि की मांसपेशियों पर एक छोटा चीरा बनाएं। तब। एचसीटी को इंजेक्ट करने के लिए मांसपेशियों पर बाहरी प्रावरणी को छेदें धीरे-धीरे वापस लेने से पहले माइक्रोपिपेट को पांच से 10 सेकंड के लिए स्थिति में छोड़ दें।

इंजेक्शन के बाद, चीरों को एक से दो टांके के साथ बंद करें। फिर, माउस को 30 मिनट के लिए अवलोकन के तहत एक पृथक वसूली पिंजरे में स्थानांतरित करें। सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर सर्जिकल उपकरण और उपकरणों की व्यवस्था करके कटिस्नायुशूल तंत्रिका को उजागर करने के लिए तैयार करें।

इमेजिंग प्रक्रिया की सहायता के लिए एक कोण टिप के साथ एक सेंटीमीटर चौड़ाई के एक संकीर्ण आयत में पैराफिल्म काटकर एक पच्चर बनाएं। एक बार तैयारी हो जाने के बाद, सर्जिकल क्षेत्र में मुखपत्र में माउस को स्थानांतरित करें और मुखपत्र को सिर को सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप का उपयोग करें। सर्जिकल टेप के साथ मिडलाइन से 45 डिग्री पर लक्षित हिंद अंग का विस्तार और सुरक्षित करें।

यदि कॉर्नियल और पेडल निकासी सजगता अनुपस्थित हैं, तो कैंची का उपयोग करके कटिस्नायुशूल तंत्रिका को ओवरले करने वाली त्वचा को काट लें। फिर, कटिस्नायुशूल तंत्रिका और रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना ओवरलाइंग बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशियों और मांसलता या संयोजी ऊतक को हटा दें। जब बरकरार कटिस्नायुशूल तंत्रिका पर्याप्त रूप से उजागर होती है, तो निर्जलीकरण को रोकने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका के आसपास के क्षेत्र में पूर्व-गर्म बाँझ खारा लागू करें।

फिर, गहरे झूठ बोलने वाले संयोजी ऊतक को बाधित करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें और तंत्रिका के नीचे पूर्व-तैयार पैराफिल्म वेज रखें। आइसोफ्लूरेन और ऑक्सीजन से भरे प्रेरण कक्ष में गर्मी चटाई के शीर्ष पर माउस को स्थानांतरित करने से पहले उजागर क्षेत्र पर खारा-भिगोए हुए कपास ऊन रखें। इमेजिंग के लिए, अनुकूलित माइक्रोस्कोप चरण पर 22-बाय -64 मिलीमीटर कवर ग्लास रखें और टेप के साथ कवर ग्लास की स्थिति को सुरक्षित करें।

उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल लागू करने के बाद, उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए माइक्रोस्कोप चरण कनेक्ट करें और धीरे-धीरे कवर ग्लास से संपर्क करने के लिए तेल-विसर्जित उद्देश्य बढ़ाएं। जब सेटअप तैयार हो जाता है, तो टेप का उपयोग करके माइक्रोस्कोप चरण पर संवेदनाहारी मुखपत्र को सुरक्षित करें। फिर, कटिस्नायुशूल तंत्रिका से कपास ऊन को हटा दें और कवर ग्लास का सामना करने वाले उजागर तंत्रिका के साथ प्रेरण कक्ष से मुखपत्र में माउस को स्थानांतरित करें।

मुखपत्र के लिए माउस के सिर को सुरक्षित करें, और संज्ञाहरण के सबसे कम पर्याप्त स्तर को बनाए रखते हुए, उजागर कटिस्नायुशूल तंत्रिका के पास कवर पर्ची में बाँझ खारा जोड़ने के लिए धीरे-धीरे अपनी पूंछ से माउस उठाएं। ओकुलर की मदद से, इष्टतम फोकल बिंदु निर्धारित करने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका का पता लगाएं और मोटाइल एक्सोनल ऑर्गेनेल युक्त ब्याज के क्षेत्र का चयन करें। अगला, अधिग्रहण बटन पर क्लिक करके और रुचि के क्षेत्र का चयन करके कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर पर स्विच करें।

80 गुना आवर्धन प्राप्त करने के लिए डिजिटल ज़ूम का उपयोग करें और अक्षतंतुओं को क्षैतिज रूप से कल्पना करने के लिए चयनित क्षेत्र को घुमाएं क्षेत्र बॉक्स पर क्लिक करें और रुचि के आयताकार क्षेत्र का चयन करें। अधिग्रहण मोड में, फ्रेम आकार को न्यूनतम 1024-बाय -1024 पिक्सेल पर सेट करें और 100 से 1,000 फ्रेम का समय चूक अधिग्रहण शुरू करें। माउस प्रति तीन अक्षतंतु से 10 मोटाइल कार्गो की एक न्यूनतम पर कब्जा।

अध्ययन में, विवो मोटर एक्सोन-स्पेसिफिक लेबलिंग ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। कोलीनर्जिक मोटर अक्षतंतु में बढ़ी हुई हरी पुष्पक्रम प्रोटीन, या ईजीएफपी अभिव्यक्ति, एक जीवित, संवेदनाहारी सीएचएटी से देखी गई थी। ईजीएफपी माउस।

वैकल्पिक विधि के साथ, एक चैट से ताजा उत्तेजित तंत्रिका में टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति। टीडीटोमैटो माउस अतिरिक्त ऊतक प्रसंस्करण के बिना प्राप्त किया गया था। इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों में ईजीएफपी को एन्कोडिंग करने वाले एचसीटी या एडेनोवायरस जैसे ट्रेसर या मार्करों को इंजेक्ट करके अक्षतंतु की पहचान की गई थी।

प्रतिनिधि विश्लेषण एक एचबी 9 के लाइव मोटर न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो एक्सोनल परिवहन में प्रतिनिधित्व करने वाली एक समय चूक छवि श्रृंखला को दर्शाता है। जीएफपी माउस। जीएफपी में एचबी 9 में अधिक दानेदार पैटर्न था।

जीएफपी अक्षतंतु। मितो का प्रजनन। सीएटी के साथ सीएफपी चूहों।

टीडीटोमैटो चूहों ने मोटर अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के दृश्य को सक्षम किया। इसके अलावा, रणवीर के नोड की भी पहचान की जा सकती है। मिटो की मांसपेशियों में एचसीटी इंजेक्शन।

सीएफपी चूहों ने विवो में एक ही अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के समवर्ती दृश्य की अनुमति दी। पूर्वकाल और प्रतिगामी रूप से चलने वाले ऑर्गेनेल, साथ ही रुके हुए ऑर्गेनेल देखे गए। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान कम संज्ञाहरण फायदेमंद है क्योंकि यह बड़ी श्वास कलाकृतियों के प्रभाव को सीमित कर सकता है, और इस प्रकार अक्षीय परिवहन की ट्रैकिंग और विश्लेषण को सरल बना सकता है।

कटिस्नायुशूल तंत्रिकाएं आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए शिक्षाप्रद हो सकती हैं ताकि अक्षतंतु परिवहन मशीनरी के प्रमुख घटकों, जैसे मोटर प्रोटीन और कार्गो-विशिष्ट एडाप्टर के साथ ऑर्गेनेल गतिशीलता को सहसंबंधित किया जा सके।