Ved hjelp av vår protokoll kan vi visualisere og kvantitativt vurdere dynamikken i signalering av endosomer og mitokondrier i aksoner fra motoriske og sensoriske nevroner av levende bedøvede mus. Denne metoden som kan brukes til å forstå den basale fysiologien til aksoner in vivo og avsløre viktig patomekanisme som driver perifer nevrodegenerasjon i musemodell av sykdom. Vår teknikk kan brukes til å vurdere effekten av potensielle behandlinger som farmakologiske midler og genterapier på aksonal transport i levende motoriske og sensoriske nevroner.
Denne teknikken kan brukes til samtidig å avbilde forskjellige organeller i en bestemt perifer nerve axon og videresende studiet av motoriske sykdomsmodeller samt aldring. Start forberedelsene ved å trekke en gradert glassmikropipette for optimale intramuskulære injeksjoner i mindre muskler. For operasjonen, sikre en steril kirurgisk drapering på en varmematte satt til 37 grader Celsius og plasser og fokuser operasjonsmikroskopet.
Pakk deretter ut alle nødvendige kirurgiske verktøy og instrumenter som beskrevet i manuskriptet. Når forberedelsene er ferdige, overfør den bedøvede musen til munnstykket som ligger i et eget område av operasjonsområdet og sørg for at både hornhinnen og pedaluttaksrefleksene er fraværende før du barberer pelsen av det kirurgiske området. Fjern deretter den barberte pelsen fra musen ved hjelp av den klebrige siden av kirurgisk tape.
Deretter plasserer du musen på veievekter for å registrere den prekirurgiske vekten. Bruk deretter en bomullspinne til å påføre øyesmøremiddel og overfør musen og munnstykket til det kirurgiske området. For å injisere tibialis anterior, eller TA muskel, plasser musen på ryggen og strekk ut bakbenet ved 10 grader fra midtlinjen.
Når bakbenet er i riktig posisjon, legg et kirurgisk tape over foten. Steriliser det barberte området ved hjelp av en 70% etanol eller tilsvarende løsning. Tegn det fungerende atoksiske fragmentet av stivkrampe, nevrotoksin eller HcT-løsning i en trukket glassmikropipette.
Deretter gjør du et lite snitt over muskelen av interesse i området som tilsvarer motor- og plateområdene. Da. pierce den ytre fascia på muskelen for å injisere HcT. La mikropipetten stå på plass i fem til 10 sekunder før du sakte trekker deg ut.
Etter injeksjonen, lukk snittene med en til to masker. Overfør deretter musen til et isolert gjenopprettingsbur under observasjon i 30 minutter. Forbered deg på å eksponere isjiasnerven ved å ordne kirurgiske verktøy og instrumenter rundt det kirurgiske området.
Lag en kile ved å kutte parafilm i et smalt rektangel med bredde en centimeter med en vinklet spiss for å hjelpe bildeprosessen. Når forberedelsene er ferdige, overfør musen til munnstykket i det kirurgiske området og bruk kirurgisk tape for å feste hodet til munnstykket. Forleng og fest den målrettede bakbenet ved 45 grader fra midtlinjen med kirurgisk tape.
Hvis hornhinnen og pedalabstinensreflekser er fraværende, kutt huden over isjiasnerven ved hjelp av saks. Fjern deretter den overliggende biceps femoris muskelen og muskulaturen eller bindevevet uten å skade isjiasnerven og blodårene. Når den intakte isjiasnerven er tilstrekkelig eksponert, påfør forvarmet steril saltvann til området rundt isjiasnerven for å forhindre uttørking.
Bruk deretter buede tang for å forstyrre det dyptliggende bindevevet og plasser den forberedte parafilmkilen under nerven. Plasser saltvannsdynket bomullsull på det eksponerte området før du beveger musen på toppen av varmematten inn i induksjonskammeret fylt med isofluran og oksygen. For bildebehandling, plasser et 22 x 64 millimeter dekselglass på det tilpassede mikroskoptrinnet og fest posisjonen til dekselglasset med et bånd.
Etter å ha påført nedsenkingsolje til målet, koble mikroskoptrinnet til det inverterte mikroskopet og øk sakte det olje-nedsenkede målet for å kontakte dekselglasset. Når oppsettet er klart, fest det bedøvelsesmunnstykket på mikroskopstadiet ved hjelp av tape. Fjern deretter bomullsullen fra isjiasnerven og overfør musen fra induksjonskammeret til munnstykket med den eksponerte nerven vendt mot dekkglasset.
Fest musens hode til munnstykket, og mens du opprettholder det laveste tilstrekkelige nivået av anestesi, løft musen forsiktig etter halen for å legge steril saltvann til dekselet slip nær den eksponerte isjiasnerven. Ved hjelp av okularet, finn isjiasnerven for å bestemme det optimale fokuspunktet og velg et interesseområde som inneholder motile aksonale organeller. Deretter bytter du til dataprogramvaren ved å klikke på Anskaffelse-knappen og velge et interesseområde.
Bruk digital zoom til å oppnå en 80 ganger forstørrelse, og roter det valgte området for å visualisere aksonene vannrett Klikk Områder-boksen og velg et rektangulært interesseområde. I anskaffelsesmodus angir du bildestørrelsen til minimum 1024 x 1024 piksler og starter tidsregistrering av 100 til 1 000 bilder. Fang minst 10 bevegelige laster fra de tre aksonene per mus.
I studien ble in vivo motorakson-specifc merking oppnådd ved bruk av transgene mus. Det forbedrede grønne florescensproteinet, eller eGFP-uttrykket, i kolinerge motoraksoner ble observert fra en levende, bedøvet ChAT. eGFP mus.
Med den alternative metoden, tdTomato uttrykk i en ferskt skåret nerve fra en ChAT. tdTomato mus ble oppnådd uten ytterligere vevsbehandling. I tillegg ble aksoner identifisert ved å injisere sporstoffer eller markører som HcT eller adenovirus som koder for eGFP i skjelettmuskler.
Den representative analysen demonstrerer en time lapse-bildeserie som representerer in vivo aksonal transport av signalende endosomer i levende motorneuroner i en HB9. GFP mus. GFP hadde et mer detaljert mønster i HB9.
GFP aksoner. Oppdrett av Mito. CFP mus med ChAT.
tdTomato-mus muliggjorde visualisering av mitokondrier i motoraksonene. Videre kunne Ranviers node også identifiseres. HcT-injeksjonen i musklene i Mito.
CFP-mus tillot samtidig visualisering av signalende endosomer og mitokondrier innenfor de samme aksonene in vivo. Anterogradely og retrogradely bevegelige organeller, samt stalled organeller, ble observert. Redusert anestesi under bildebehandlingsprosessen er fordelaktig fordi det kan begrense virkningen av store pusteartefakter, og dermed forenkle sporing og analyse av aksonal transport.
Isjiasnerver kan være lærerike for RNA- og proteinanalyse for å korrelere organelldynamikken med nøkkelkomponenter i det aksonale transportmaskineriet, for eksempel motorproteiner og lastspesifikke adaptere.