Denne metode erhverver levende skiver af kyllingens auditive hjernestamme, som omfatter en større gradient af frekvensområdet i samme skive. Disse skiver er velegnede til elektrofysiologiske og anatomiske eksperimenter med en større tonotopisk akse. Denne metode hjælper med at forstå mikrokredsløbsudvikling i den auditive hjernestamme.
Mens anatomien er specifik for kyllingen, har andre fuglearter som vagtler og sangfugle lignende anatomi. Til at begynde med steriliseres æggene med 70% ethanol og inkuberer dem ved 38 grader Celsius og 50% fugtighed. Indstil derefter boblehastigheden for ACSF, således at pH er 7,2 til 7,4 med en osmolalitet mellem 300 og 310 milliosmolar pr. Liter.
Bland derefter fem gram agarose i 100 ml dACSF. Opløs agarosen fuldstændigt ved hjælp af et vandbad eller mikrobølgeovn, indtil agarosen begynder at boble. Hæld den smeltede agarose i en petriskål op til en tykkelse på fem millimeter og hold ved stuetemperatur for at indstille.
Efter indstilling forsegles petriskålen og opbevares ved fire grader Celsius. Skær agarosen i kabineblokke til brug på dissektionstidspunktet. Rengør først dissektionsområdet ved hjælp af 70% ethanol.
Lim den understøttende eller vinklede agaroseblok på vibratombakken. Placer ægget under et stærkt lys, og find det luftfyldte rum på den større eller rundere side af ægget, knæk derefter skallen over det luftfyldte rum og udsæt membransækken. Lav et blidt snit i sækken for at udsætte næb.
Træk forsigtigt halsen og hovedet ud af ægget med en skalpel. Efter halshugning skal du rengøre hovedet med kølet dACSF. Hold hovedet stabilt i kølet dACSF og lav et rostrocaudalt snit.
Start snittet bag og mellem øjnene og følg længden af den høstede hals. Adskil huden for at udsætte kraniet. Skær kraniet bag øjet i midterlinjen til lateral retning.
Gentag for begge halvkugler. Skær den rostrale del af kraniet ved at placere bladet bag øjnene og lave et hurtigt snit. Derefter nedsænkes hovedet i en skål med kølet dACSF.
Brug en lille saks til at lave midterlinje til laterale snit i kraniets kaudale område for at adskille hjernen uden at forårsage vævsskade. Udsæt forsigtigt hjernestammen og lillehjernen. Træk det dorsale område af hele kraniet tilbage.
Fjern hjernestammen og udsæt den ved mild pensling med en fin pensel. Brug buede tang til at rense hjernestammen fra at forbinde væv og blodkar. Adskil hjernestammen fra lillehjernen ved at skære peduncles og fjerne blodkarrene omhyggeligt.
Trim hjernestammen af yderligere blodkar. Placer først vibratombladet langs den vandrette akse. Til koronale skiver limes hjernestammen på en skærebakke ved rostralsiden og holder rostrocaudalaksen lodret.
For sagittale skiver skal du holde den laterale mediale akse lodret. For vandrette skiver limes den ventrale side, der holder den dorsale ventralakse lodret. For at opnå det akutte vinklede sagittale vandrette plan limes den ventrale side af hjernestammen, således at den ventrale dorsale akse er lodret på hypotenusoverfladen agaroseblok.
Lim den modsatte overflade af agaroseblokken mod skærebakken, og hold rostrocaudalaksen parallel med knivkanten. Som et alternativ til vibratomudskæring nedsænkes den isolerede hjernestamme i 4% lavt smeltepunkt agarose ved 40 grader Celsius i en 35 x 10 millimeter petriskål. Når agarosen er størknet, skal du skære kabinen agaroseblokken ved hjælp af et skarpt barberblad.
Lim agaroseblokken på dens rostrale side, der holder hjernestammens rostrocaudal akse lodret. Tag koronale skiver, indtil NM-regionen ses. Fjern agaroseblokken fra limen med et skarpt blad.
Med en fin nål placeres forsigtigt 0,5 mikroliter toluidinblåt farvestof på NM for at få øje på kernerne. Monter denne blok igen på skærebakken til sagittale eller vandrette skiver. Identificer kernerne med hensyn til det farvede område og del hjernestammen.
Efter sektionering anbringes de 200 til 300 mikron sekventielt opsamlede skiver i et skiveskåret kammer indeholdende ACSF for at ligevægte i en time ved stuetemperatur. Koronale sektioner af hjernestammevæv fra et E19 til 21 kyllingembryo repræsenterer de relative isofrekvensområder af de auditive hjernestammekerner fra den laveste til den højeste karakteristiske frekvens auditive region. De afferente auditive nervefibre og bifurcationen af NM-axoner var synlige.
Nucleus angularis blev også observeret. I rostralsektioner er den overlegne olivarkerne placeret langs den ventrale laterale region af koronalskiven. I sagittale sektioner blev NM og nucleus laminaris eller NL identificeret, hvor de auditive nervefibre kom ind i klyngen af neuroner.
Den overlegne olivarkerne blev identificeret i den rostrolaterale region. Lave og høje karakteristiske auditive regioner fra NM og NL langs rostrocaudalaksen blev set. Den mest mediale skive viste de ipsilaterale og kontralaterale axonale tufts og slutpunktet for den auditive region.
I de vandrette skiver blev NM og NL identificeret mod midterlinjen, og neuroner blev spredt langs den laterale mediale akse. Skiver af hjernestammevævet i en spids vinkel fra et vandret plan viste de auditive hjernestammekerner over en stor diagonal spredning. Forstørrede billeder viste den tonotopiske akse af de auditive kerner langs den rostromediale til caudolaterale akse.
Sørg for, at hele processen udføres i iskølet dACSF kontinuerligt boblet med kulhydratoxygen. Denne protokol bruges til forskere, der undersøger anatomiske og biofysiske egenskaber ved at udvikle hjernestammemikrokredsløb, specifikt forholdet mellem de store auditive kerner.