यह विधि चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम के लाइव स्लाइस प्राप्त करती है जिसमें एक ही टुकड़े में आवृत्ति क्षेत्र का एक बड़ा ढाल शामिल होता है। ये स्लाइस एक बड़े टोनोटोपिक अक्ष के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और शारीरिक प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। यह पद्धति श्रवण ब्रेनस्टेम में माइक्रोसर्किट विकास को समझने में मदद करेगी।
जबकि शरीर रचना विज्ञान चिकन के लिए विशिष्ट है, बटेर और सॉन्गबर्ड जैसी अन्य एवियन प्रजातियों में समान शरीर रचना विज्ञान है। शुरू करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ अंडे को निष्फल करें और उन्हें 38 डिग्री सेल्सियस और 50% आर्द्रता पर सेते हैं। अगला, एसीएसएफ के लिए बुदबुदाहट दर निर्धारित करें जैसे कि पीएच 300 और 310 मिलीओस्मोलर प्रति लीटर के बीच ऑस्मोलैलिटी के साथ 7.2 से 7.4 है।
फिर डीएसीएसएफ के 100 मिलीलीटर में पांच ग्राम एगरोज मिलाएं। पानी के स्नान या माइक्रोवेव का उपयोग करके एगरोज़ को पूरी तरह से भंग करें जब तक कि एगरोज़ बुदबुदाना शुरू न हो जाए। पिघले हुए एगरोज़ को पेट्री डिश में पांच मिलीमीटर की मोटाई तक डालें और सेट करने के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
सेटिंग के बाद, पेट्री डिश को सील करें और चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विच्छेदन के समय उपयोग के लिए एग्रोज़ को क्यूबिकल ब्लॉक में काटें। सबसे पहले, 70% इथेनॉल का उपयोग करके विच्छेदन क्षेत्र को साफ करें।
वाइब्रेटोम ट्रे पर सहायक या कोण वाले एगरोज़ ब्लॉक को गोंद करें। अंडे को एक उज्ज्वल प्रकाश के नीचे रखें और अंडे के बड़े या गोल पक्ष पर हवा से भरे स्थान का पता लगाएं, फिर हवा से भरे स्थान पर खोल को क्रैक करें और झिल्ली थैली को उजागर करें। चोंच को बेनकाब करने के लिए थैली में एक कोमल चीरा बनाएं।
स्केलपेल के साथ, धीरे-धीरे गर्दन और सिर को अंडे से बाहर खींचें। डिकैपिटेशन के बाद, ठंडा डीएसीएसएफ के साथ सिर को साफ करें। ठंडा डीएसीएसएफ में सिर को स्थिर रखें और एक रोस्ट्रोकॉडल चीरा बनाएं।
आंखों के पीछे और बीच चीरा शुरू करें और कटी हुई गर्दन की लंबाई का पालन करें। खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को अलग करें। आंख के पीछे खोपड़ी को मध्य रेखा में पार्श्व दिशा में काटें।
दोनों गोलार्धों के लिए दोहराएं। आंखों के पीछे ब्लेड रखकर और एक त्वरित कटौती करके खोपड़ी के रोस्ट्रल भाग को स्लाइस करें। फिर ठंडा डीएसीएसएफ के एक पकवान में सिर विसर्जित करें।
छोटी कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, ऊतक क्षति के बिना मस्तिष्क को अलग करने के लिए खोपड़ी के दुम क्षेत्र में पार्श्व चीरों के लिए मिडलाइन बनाएं। धीरे-धीरे ब्रेनस्टेम और सेरिबैलम को उजागर करें। पूरी खोपड़ी के पृष्ठीय क्षेत्र को वापस लें।
ब्रेनस्टेम निकालें और एक ठीक पेंट ब्रश का उपयोग करके हल्के ब्रश करके इसे उजागर करें। ऊतक और रक्त वाहिकाओं को जोड़ने से ब्रेनस्टेम को साफ करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। पेडुनकल्स को काटकर और रक्त वाहिकाओं को सावधानीपूर्वक हटाकर ब्रेनस्टेम को सेरिबैलम से अलग करें।
अतिरिक्त रक्त वाहिकाओं के ब्रेनस्टेम को ट्रिम करें। सबसे पहले, क्षैतिज अक्ष के साथ वाइब्रेटोम ब्लेड रखें। कोरोनल स्लाइस के लिए, रोस्ट्रल साइड द्वारा एक स्लाइसिंग ट्रे पर ब्रेनस्टेम को गोंद करें, रोस्ट्रोकॉडल अक्ष को ऊर्ध्वाधर रखते हुए।
धनु स्लाइस के लिए, पार्श्व औसत दर्जे का अक्ष ऊर्ध्वाधर रखें। क्षैतिज स्लाइस के लिए, पृष्ठीय उदर अक्ष ऊर्ध्वाधर रखते हुए उदर पक्ष को गोंद करें। तीव्र कोणीय धनु क्षैतिज विमान को प्राप्त करने के लिए, ब्रेनस्टेम के उदर पक्ष को गोंद करें जैसे कि उदर पृष्ठीय अक्ष कर्ण सतह एगरोज़ ब्लॉक पर ऊर्ध्वाधर है।
टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे का सामना करने वाले एगरोज़ ब्लॉक की विपरीत सतह को गोंद करें और ब्लेड किनारे के समानांतर रोस्ट्रोकॉडल अक्ष रखें। वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के विकल्प के रूप में, पृथक ब्रेनस्टेम को 35 से 10 मिलीमीटर पेट्री डिश में 40 डिग्री सेल्सियस पर 4% कम पिघलने बिंदु एगरोज़ में विसर्जित करें। एगरोज़ जमने के बाद, एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके क्यूबिकल एगरोज़ ब्लॉक को काट लें।
ब्रेनस्टेम ऊर्ध्वाधर के रोस्ट्रोकॉडल अक्ष को रखते हुए अपने रोस्ट्रल पक्ष पर एगारोज़ ब्लॉक को गोंद करें। एनएम क्षेत्र देखे जाने तक कोरोनल स्लाइस लें। एक तेज ब्लेड के साथ गोंद से एगरोज़ ब्लॉक निकालें।
एक ठीक सुई के साथ, नाभिक को स्पॉट करने के लिए एनएम पर टोलुइडीन ब्लू डाई के 0.5 माइक्रोलीटर धीरे-धीरे रखें। धनु या क्षैतिज स्लाइस के लिए टुकड़ा करने की क्रिया ट्रे पर इस ब्लॉक को फिर से शुरू करें। दाग वाले क्षेत्र के संबंध में नाभिक की पहचान करें और ब्रेनस्टेम को खंडित करें।
सेक्शनिंग के बाद, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए संतुलित करने के लिए एसीएसएफ युक्त कटा हुआ कक्ष में क्रमिक रूप से एकत्र किए गए 200 से 300 माइक्रोन स्लाइस रखें। ई 19 से 21 चिकन भ्रूण तक ब्रेनस्टेम ऊतक के कोरोनल खंड श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक के सापेक्ष आइसोफ्रीक्वेंसी क्षेत्रों को सबसे कम से उच्चतम विशेषता आवृत्ति श्रवण क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। अभिवाही श्रवण तंत्रिका तंतुओं और एनएम अक्षतंतु का द्विभाजन दिखाई दे रहा था।
नाभिक कोणीयता भी देखी गई थी। रोस्ट्रल वर्गों में, बेहतर ओलिवरी नाभिक कोरोनल स्लाइस के उदर पार्श्व क्षेत्र के साथ स्थित है। धनु वर्गों में, एनएम और नाभिक लैमिनारिस या एनएल की पहचान की गई जहां श्रवण तंत्रिका तंतु न्यूरॉन्स के क्लस्टर में प्रवेश करते थे।
रोस्ट्रोलेटरल क्षेत्र में बेहतर ओलिवरी नाभिक की पहचान की गई थी। रोस्ट्रोकॉडल अक्ष के साथ एनएम और एनएल से कम और उच्च विशेषता आवृत्ति श्रवण क्षेत्रों को देखा गया था। सबसे औसत दर्जे का टुकड़ा इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल एक्सोनल टफ्ट्स और श्रवण क्षेत्र के अंतिम बिंदु को दिखाता है।
क्षैतिज स्लाइस में, एनएम और एनएल को मिडलाइन की ओर पहचाना गया था, और न्यूरॉन्स पार्श्व औसत दर्जे की धुरी के साथ फैले हुए थे। क्षैतिज विमान से एक तीव्र कोण पर ब्रेनस्टेम ऊतक के स्लाइस ने एक बड़े विकर्ण प्रसार में श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक दिखाया। आवर्धित छवियों ने श्रवण नाभिक के टोनोटोपिक अक्ष को रोस्ट्रोमेडियल से कॉडोलेट्रल अक्ष के साथ दिखाया।
सुनिश्चित करें कि पूरी प्रक्रिया बर्फ ठंडा डीएसीएसएफ में लगातार कार्ब ऑक्सीजन के साथ बुलबुला किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किट विकसित करने की शारीरिक और बायोफिजिकल संपत्ति की जांच करने वाले शोधकर्ताओं के लिए किया जाता है, विशेष रूप से प्रमुख श्रवण नाभिक के बीच संबंध।