이 방법은 동일한 슬라이스에서 주파수 영역의 더 큰 구배를 포함하는 닭 청각 뇌간의 살아있는 조각을 얻습니다. 이 슬라이스는 더 큰 안압 축을 가진 전기 생리 학적 및 해부학 적 실험에 적합합니다. 이 방법론은 청각 뇌간의 미세 회로 발달을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
해부학은 닭에만 해당되지만 메추라기 및 송 버드와 같은 다른 조류 종은 유사한 해부학을 가지고 있습니다. 시작하려면 70 % 에탄올로 알을 살균하고 섭씨 38도 및 50 % 습도에서 배양하십시오. 다음으로, ACSF의 버블 링 속도를 설정하여 pH가 7.2에서 7.4가되고 삼투압이 리터당 300에서 310 밀리 오스몰 사이가되도록하십시오.
그런 다음 100 밀리리터의 dACSF에 5 그램의 아가 로스를 섞는다. 아가로스가 버블링되기 시작할 때까지 수조 또는 전자레인지를 사용하여 아가로스를 완전히 녹입니다. 녹은 아가 로스를 페트리 접시에 최대 5 밀리미터의 두께로 붓고 실온에서 보관하십시오.
세팅 후 페트리 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 해부시 사용하기 위해 아가 로스를 칸막이 블록으로 자릅니다. 먼저 70 % 에탄올을 사용하여 해부 부위를 청소하십시오.
지지 또는 각진 아가로스 블록을 비브라톰 트레이에 붙입니다. 밝은 빛 아래에 계란을 놓고 계란의 더 크거나 둥근 쪽에 공기가 채워진 공간을 찾은 다음 공기가 채워진 공간 위에 껍질을 깨고 막 주머니를 노출시킵니다. 부리를 노출시키기 위해 주머니를 부드럽게 절개하십시오.
메스로 목과 머리를 계란에서 부드럽게 잡아 당깁니다. 참수 후 식힌 dACSF로 머리를 청소하십시오. 차가운 dACSF에서 머리를 단단히 잡고 연단 절개를하십시오.
눈 뒤와 눈 사이의 절개를 시작하고 수확 된 목의 길이를 따르십시오. 두개골을 노출시키기 위해 피부를 분리하십시오. 눈 뒤의 두개골을 정중선에서 측면 방향으로 자릅니다.
양쪽 반구에 대해 반복합니다. 칼날을 눈 뒤에 놓고 빠르게 잘라 두개골의 부분을 자릅니다. 그런 다음 차가운 dACSF 접시에 머리를 담그십시오.
한 쌍의 작은 가위를 사용하여 두개골의 꼬리 부위에서 정중선에서 측면 절개를 만들어 조직 손상없이 뇌를 분리합니다. 뇌간과 소뇌를 부드럽게 노출시킵니다. 전체 두개골의 등 부분을 수축시킵니다.
뇌간을 제거하고 미세한 페인트 브러시를 사용하여 가볍게 칫솔질하여 노출시킵니다. 구부러진 집게를 사용하여 조직과 혈관을 연결하는 뇌간을 청소하십시오. 꽃자루를 자르고 혈관을 조심스럽게 제거하여 뇌간을 소뇌에서 분리하십시오.
추가 혈관의 뇌간을 다듬습니다. 먼저 비브라톰 블레이드를 수평축을 따라 놓습니다. 관상 조각의 경우 쪽의 슬라이스 트레이에 뇌간을 붙이고 축을 수직으로 유지합니다.
시상 조각의 경우 측면 내측 축을 수직으로 유지하십시오. 수평 슬라이스의 경우 등쪽 복부 축을 수직으로 유지하면서 복부 쪽을 붙입니다. 급성 각도 시상 수평면을 달성하려면 뇌간의 복부 쪽을 접착하여 복부 등쪽 축이 빗변 표면 아가 로스 블록에서 수직이되도록하십시오.
슬라이스 트레이를 향한 아가 로스 블록의 반대쪽 표면을 붙이고 로스트로 코 달 축을 블레이드 가장자리와 평행하게 유지하십시오. 비브라톰 슬라이싱의 대안으로, 분리된 뇌간을 섭씨 40도의 낮은 융점 아가로세에 35 x 10mm 페트리 접시에 담급니다. 아가 로스가 고형화 된 후 날카로운 면도날을 사용하여 칸막이 아가 로스 블록을 자릅니다.
쪽에 아가로스 블록을 붙이고 뇌간의 연단축을 수직으로 유지합니다. NM 영역이 보일 때까지 관상 슬라이스를 가져 가십시오. 날카로운 칼날로 접착제에서 아가 로스 블록을 제거하십시오.
가는 바늘로 0.5마이크로리터의 톨루이딘 블루 염료를 NM에 부드럽게 놓아 핵을 찾습니다. 이 블록을 시상 또는 수평 슬라이스를 위해 슬라이싱 트레이에 다시 장착합니다. 염색 된 영역과 뇌간 절편에 대한 핵을 식별하십시오.
절편화 후, 순차적으로 수집된 200 내지 300 마이크론 슬라이스를 ACSF를 함유하는 슬라이스된 챔버에 넣고 실온에서 1시간 동안 평형을 이룬다. E19에서 21 닭 배아까지의 뇌간 조직의 관상 절편은 청각 뇌간 핵의 상대적 등주파 영역을 가장 낮은 특성 주파수 청각 영역에서 가장 높은 빈도로 나타냅니다. 구 심성 청각 신경 섬유와 NM 축삭의 분기가 보였다.
핵 각도도 관찰되었다. 절편에서, 상부 olivary 핵은 관상 동맥 슬라이스의 복부 측면 영역을 따라 위치한다. 시상 절편에서 NM과 핵 층류 또는 NL은 청각 신경 섬유가 뉴런 클러스터에 들어간 곳을 확인했습니다.
우수한 올리 바리 핵은 복측 영역에서 확인되었습니다. ROSTROCAUDAL 축을 따라 NM 및 NL의 낮고 높은 특성 주파수 청각 영역이 나타났습니다. 가장 내측 슬라이스는 동측 및 반대쪽 축삭 술과 청각 영역의 끝점을 보여주었습니다.
수평 슬라이스에서 NM과 NL은 정중선을 향해 확인되었고 뉴런은 측면 내측 축을 따라 퍼졌습니다. 수평면에서 예각으로 뇌간 조직의 조각은 큰 대각선 확산을 가로 지르는 청각 뇌간 핵을 보여주었습니다. 확대 된 이미지는 청각 핵의 긴장 축을 따라 내측에서 꼬리 측으로 나타났습니다.
전체 공정이 탄수화물 산소로 지속적으로 버블링된 얼음처럼 차가운 dACSF에서 수행되는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 뇌간 미세 회로 개발의 해부학 적 및 생물 물리학 적 특성, 특히 주요 청각 핵 간의 관계를 조사하는 연구자에게 사용됩니다.
