Denna metod förvärvar levande skivor av kycklingens auditiva hjärnstam som omfattar en större gradient av frekvensregionen i samma skiva. Dessa skivor är lämpliga för elektrofysiologiska och anatomiska experiment med en större tonotopisk axel. Denna metod hjälper till att förstå mikrokretsutveckling i den auditiva hjärnstammen.
Medan anatomin är specifik för kycklingen, har andra fågelarter som vaktlar och sångfåglar liknande anatomi. Börja med att sterilisera äggen med 70% etanol och inkubera dem vid 38 grader Celsius och 50% fuktighet. Ställ sedan in bubblingshastigheten för ACSF så att pH är 7,2 till 7,4 med en osmolalitet mellan 300 och 310 milliosmolär per liter.
Blanda sedan fem gram agaros i 100 ml dACSF. Lös upp agarosen helt med ett vattenbad eller mikrovågsugn tills agarosen börjar bubbla. Häll den smälta agarosen i en petriskål upp till en tjocklek av fem millimeter och håll vid rumstemperatur för att ställa in.
Efter inställning, försegla petriskålen och förvara vid fyra grader Celsius. Skär agarosen i båsblock för användning vid dissektionstillfället. Rengör först dissektionsområdet med 70% etanol.
Limma det bärande eller vinklade agarosblocket på vibratombrickan. Placera ägget under ett starkt ljus och lokalisera det luftfyllda utrymmet på den större eller rundare sidan av ägget, knäck sedan skalet över det luftfyllda utrymmet och exponera membransäcken. Gör ett försiktigt snitt i säcken för att exponera näbben.
Med en skalpell, dra försiktigt nacken och huvudet ur ägget. Efter halshuggning, rengör huvudet med kyld dACSF. Håll huvudet stadigt i kyld dACSF och gör ett rostrocaudalt snitt.
Starta snittet bakom och mellan ögonen och följ längden på den skördade nacken. Separera huden för att exponera skallen. Skär skallen bakom ögat i mittlinjen till sidoriktning.
Upprepa för båda halvklotet. Skär den rostrala delen av skallen genom att placera bladet bakom ögonen och göra ett snabbt snitt. Sänk sedan ner huvudet i en skål med kyld dACSF.
Använd en liten sax och gör mittlinjen till laterala snitt i den kaudala regionen av skallen för att separera hjärnan utan att orsaka vävnadsskada. Exponera försiktigt hjärnstammen och lillhjärnan. Dra tillbaka dorsalområdet i hela skallen.
Ta bort hjärnstammen och exponera den genom mild borstning med en fin pensel. Använd böjda tångar för att rengöra hjärnstammen från att ansluta vävnad och blodkärl. Separera hjärnstammen från lillhjärnan genom att skära pedunclesna och ta bort blodkärlen försiktigt.
Trimma hjärnstammen av ytterligare blodkärl. Placera först vibratombladet längs den horisontella axeln. För koronala skivor, lim hjärnstammen på en skivbricka vid rostralsidan och håll rostrocaudalaxeln vertikal.
För sagittala skivor, håll den laterala mediala axeln vertikal. För horisontella skivor, limma den ventrala sidan och håll den dorsala ventralaxeln vertikal. För att uppnå det akuta vinkelsagittala horisontella planet, lim den ventrala sidan av hjärnstammen så att den ventrala dorsalaxeln är vertikal på hypotenusytans agarosblock.
Limma den motsatta ytan av agarosblocket mot skivbrickan och håll rostrocaudalaxeln parallell med bladkanten. Som ett alternativ till vibratomskivning, sänk ner den isolerade hjärnstammen i 4% låg smältpunkt agaros vid 40 grader Celsius i en petriskål på 35 x 10 millimeter. Efter att agarosen stelnat, skär båset agarosblock med ett skarpt rakblad.
Limma agarosblocket på sin rostrala sida och håll hjärnstammens rostrocaudala axel vertikal. Ta koronala skivor tills NM-regionen ses. Ta bort agarosblocket från limet med ett skarpt blad.
Med en fin nål, placera försiktigt 0,5 mikroliter toluidinblått färgämne på NM för att upptäcka kärnorna. Montera om detta block på skivfacket för sagittala eller horisontella skivor. Identifiera kärnorna med avseende på den färgade regionen och sektion av hjärnstammen.
Efter sektionering, placera de 200 till 300 mikron sekventiellt uppsamlade skivorna i en skivad kammare som innehåller ACSF för att balansera i en timme vid rumstemperatur. Koronala sektioner av hjärnstamsvävnad från ett E19 till 21 kycklingembryo representerar de relativa isofrekvensregionerna i de auditiva hjärnstamskärnorna från den lägsta till den högsta karakteristiska frekvenshörande regionen. De afferenta hörselnervfibrerna och förgreningen av NM-axoner var synliga.
Nucleus angularis observerades också. I rostrala sektioner är den överlägsna olivkärnan belägen längs den ventrala laterala regionen av koronalskivan. I sagittala sektioner identifierades NM och nucleus laminaris eller NL där hörselnervfibrerna kom in i klustret av neuroner.
Den överlägsna olivkärnan identifierades i rostrolateralområdet. Låg- och högkarakteristiska frekvens hörselregioner från NM och NL längs rostrocaudalaxeln sågs. Den mest mediala skivan visade de ipsilaterala och kontralaterala axonala tuftsna och slutpunkten för hörselområdet.
I de horisontella skivorna identifierades NM och NL mot mittlinjen, och neuroner spreds längs den laterala mediala axeln. Skivor av hjärnstamsvävnaden i en spetsig vinkel från ett horisontellt plan visade de auditiva hjärnstamskärnorna över en stor diagonal spridning. Förstorade bilder visade den tonotopiska axeln hos hörselkärnorna längs rostromedial till caudolateral axel.
Se till att hela processen utförs i iskyld dACSF kontinuerligt bubblad med kolhydratsyre. Detta protokoll används för forskare som undersöker anatomiska och biofysiska egenskaper hos att utveckla hjärnstamsmikrokretsar, särskilt förhållandet mellan de stora hörselkärnorna.
