Denne protokol kombinerer en klinisk relevant metode med en veletableret dyreforskningsmodel. Det vil hjælpe med at besvare spørgsmål om auditiv udvikling og forfining og funktionelle ændringer i hørelsen efter genetisk manipulation. Denne teknik er ikke-invasiv, så den kræver ingen operation og kan kombineres med yderligere eksperimenter.
Det tager også kun omkring en time at udføre. Denne metode kan bruges på enhver lille fugleart. Så komparativ fysiologi er relativt let.
Kyllingen ABR kan også evaluere effekten på funktionel hørelse efter genetisk manipulation. Begynd med at erhverve befrugtede hvide leghorn kyllingæg. Derefter inkuberes ægget ved 38 grader Celsius og en fugtighed på 50% i 21 dage før den ønskede testdato.
Når ægget er klækket, vejes dyret ved forsigtigt at placere det i en stor vejebåd. Efter anæstesiinjektion skal dyret placeres tilbage i inkubatoren. Kontroller derefter, om nakken er slap og klem dyrets tå ved hjælp af tang.
Som et næste trin skal du bestemme kyllingens køn ved hjælp af sine vingefjer. Senere påføres hårfjerningscreme med en bomuldsspidsapplikator på hoved- og nakkeområdet, især nær øreåbningen til fuglen. Brug nu 70% isopropylalkoholservietter til at tørre fjer af, eventuel resterende hårfjerningscreme og huden på hoved og hals.
Steriliser også de subdermale elektroder og rektal sonde ved hjælp af en 70% isopropylalkoholserviet. Placer dyret i et lydisoleret og elektrisk afskærmet kammer, der sikrer, at miljøet har minimal elektrisk og akustisk støj for de bedste optagelser. Brug en varmepude til at opretholde dyrets kropstemperatur.
Indsæt nu den rektale sonde og fastgør dyrets hoved på plads eller hvil næbbet mod et objekt for at undgå uønsket bevægelse. Sørg derefter for, at temperaturkontrolkammeret opretholder dyrets temperatur mellem 37 og 41 grader Celsius. Brug tre elektroder i rustfrit stål, sølvchloridnål som reference, aktive og almindelige jordelektroder.
Placer hver elektrode subdermalt to til tre millimeter i hovedet, men ikke dybt nok til at trænge ind i kraniet, og stik derefter elektroden ud af huden og udsætte spidsen. Ved optagelse med en enkelt kanal skal du placere den aktive elektrode over kraniet ved midterlinjen så langt kaudalt som øregangen. Placer referenceelektroden bag øret, hvor stimulusen vil blive leveret, og placer jordelektroden bag det kontralaterale øre i nakken.
Kontroller nu elektrodeimpedansen. Sørg for, at den samlede elektrodeimpedans ikke overstiger fem kilo ohm. Hold også interelektrodeimpedansen under tre kilo ohm.
Ved ABR-optagelse skal du, afhængigt af anskaffelseshardware og -software, sørge for at kalibrere de korrekte lydniveauer på tværs af de anvendte stimulusfrekvenser. Flyt nu lydtransducerapparatet mod dyrets aktive øre og læg det i en lav dybde på to millimeter i øregangen. Til sidst skal du kontrollere dyret under testen.
Hvis resultaterne ser unormale eller fraværende ud, skal du flytte lydtransduceren i øregangen. Åbn først softwaren for at erhverve ABR-optagelser. Indstil artefaktafvisningens øvre og nedre grænser til ca. 25 mikrovolt, således at dyr, bevægelse eller støj under en fejning udelukker denne fejning fra analysen.
Saml mindst 1024 fejninger for at opnå et stort gennemsnitligt svar, hvilket kan gøres i to optagelser af 512 fejninger hver. Dette sikrer, at responsen er stimulus fremkaldt og gentagelig. I forstærkerindstillingerne for softwaren skal du indstille forstærkningen til 100.000, lavpasfilteret til 3.000 Hertz og højpasfilteret til 100 Hertz.
Indstil stimuluspræsentationshastigheden mellem 10 og 20 stimuli i sekundet, og tidsvarigheden af klikstimulusen til 100 mikrosekunder. Indstil derefter samplingshastigheden til 40 kilohertz, 25 mikrosekunder for de bedste opløsningsdata og indstil stimuluspolariseringen til skiftevis. Hvis du registrerer 512 fejninger, skal du kombinere to separate tests for at skabe et 1.024 fejegennemsnit og fortsætte med at optage ved lavere og lavere intensiteter, indtil det fremkaldte potentiale ikke længere kan identificeres.
Sænk stimulusintensiteten med trin på fem decibel lydtrykniveau for at finde den laveste stimulusintensitet, der fremkalder et fremkaldt respons. Definer ABR-tærskel som den laveste stimulusintensitet, der fremkalder et påviseligt fremkaldt respons. Efter aflivning og halshugning af dyret og eksperimentet ved at rengøre varmepuden, rektal sonde og sølvchloridelektroder med 70% isopropylalkoholservietter, skal du sørge for, at alle erhvervede spor er blevet gemt.
Dette tal repræsenterer klik ABR. Wave I peak latency steg med ca. 0,3 millisekunder for hvert 20 decibel fald i stimulusintensitet. Wave I præsenterede også den største peak amplitude og den laveste peak latency variabilitet af alle bølgeform toppe.
Grafen viser toneudbruddet fremkaldt ABR. Det bedste svar blev set på 1.000 Hertz. Figuren viser, at hvis kropstemperaturen ikke opretholdes, er ABR's latensintensitetsfunktioner meget variable og ofte unøjagtige.
Figuren viser, at ABR'er registreret fra hatchlings, der er mindre end tre timer gamle, mærket som P1, har maksimale latenstider betydeligt forlænget og maksimale amplituder reduceret sammenlignet med ældre hatchlings, mærket som P2. Figuren sammenligner 75 decibel lydtryksniveau klikspor i det samme dyr med forskellige referenceelektrodeplaceringer. Bølge II peak amplitude for mastoidplaceringen opstod et millisekund efter bølge II-toppen for nakkeplaceringen. Denne tidsforskel afspejler sandsynligvis stederne for ABR neural generation i forhold til elektrodeplaceringen.
Reaktionerne mellem de to ører var ens med mindre ændringer i maksimale amplituder sandsynligvis på grund af øretelefonpositionering. Latenstiden for venstre og højre øre, der er ækvivalente, understøtter den lige så sunde funktion af både ører og hjernestammehalvkugler i den rugende kylling. Korrekt placering af lydtransducer kan skelne mellem gode og ingen resultater.
KyllingenS ABR skal være robust med et godt signal-støj-forhold. Alle de spørgsmål, der behandles af ABR-undersøgelser i andre fuglearter, kan anvendes på kyllingen. Molekylær fysiologisk forskning i embryonal kylling kan også inkorporere denne in vivo-metode.