Denne protokollen kombinerer en klinisk relevant metodikk med en veletablert dyreforskningsmodell. Det vil bidra til å svare på spørsmål om auditiv utvikling og raffinement og funksjonelle endringer i hørselen etter genetisk manipulasjon. Denne teknikken er ikke-invasiv, så det krever ingen kirurgi og kan kombineres med flere eksperimenter.
Det tar bare rundt en time å utføre. Denne metoden kan brukes på alle små fuglearter. Så komparativ fysiologi er relativt enkelt.
Kyllingen ABR kan også evaluere effekten på funksjonell hørsel etter genetisk manipulasjon. Begynn med å skaffe befruktede hvite leghorn kyllingegg. Deretter inkuberer du egget ved 38 grader Celsius og fuktighet på 50% i 21 dager før ønsket testdato.
Når egget er klekket ut, vei dyret ved å plassere det forsiktig i en stor veiebåt. Etter anestesiinjeksjon, plasser dyret tilbake i inkubatoren. Kontroller deretter om nakken er slapp og klem tåen på dyret ved hjelp av tang.
Som et neste trinn, bestem kyllingens kjønn ved hjelp av vingefjærene. Senere, påfør depilatorisk krem med en bomullsspissapplikator på hodet og nakkeområdet, spesielt i nærheten av øreåpningen for fuglen. Bruk nå 70% isopropylalkoholservietter for å tørke av fjær, eventuell gjenværende depilatorisk krem og huden på hodet og nakken.
Steriliser også subdermale elektroder og rektal sonde ved hjelp av en 70% isopropylalkoholserviett. Plasser dyret i et lydisolasjons- og elektrisk skjermet kammer, og sørg for at miljøet har minimal elektrisk og akustisk støy for de beste opptakene. Bruk en varmepute for å opprettholde dyrets kroppstemperatur.
Sett nå rektal sonde og fest dyrets hode på plass eller hvile nebbet mot et objekt for å unngå uønsket bevegelse. Deretter sikrer du at temperaturkontrollkammeret opprettholder dyrets temperatur mellom 37 og 41 grader Celsius. Bruk tre rustfritt stål, sølvkloridnålelektroder som referanse, aktive og vanlige jordelektroder.
Plasser hver elektrode subdermalt to til tre millimeter inn i hodet, men ikke dypt nok til å trenge inn i skallen, og stikk deretter elektroden ut av huden og eksponere spissen. For enkeltkanalsopptak, plasser den aktive elektroden over skallen ved midtlinjen så langt kaudal som ørekanalen. Plasser referanseelektroden bak øret der stimulansen skal leveres, og plasser jordelektroden bak det kontralaterale øret i nakken.
Kontroller nå elektrodeimpedansen. Påse at den totale elektrodeimpedansen ikke overstiger fem kilo ohm. Oppretthold også interelektrodeimpedansen under tre kilo ohm.
For ABR-opptak, avhengig av anskaffelsesmaskinvare og programvare, må du kalibrere de riktige lydnivåene på tvers av stimulusfrekvenser som brukes. Beveg nå lydtransduserapparatet mot dyrets aktive øre og plasser det i en grunn dybde på to millimeter i ørekanalen. Til slutt, sjekk dyret under testing.
Hvis resultatene ser unormale eller fraværende ut, omplasserer du lydtransduseren i ørekanalen. Først åpner du programvaren for å skaffe ABR-opptak. Sett artefaktavvisningen øvre og nedre grenser til ca. 25 mikrovolt, slik at dyr, bevegelse eller støy under en feie vil utelukke at feie fra analysen.
Samle minst 1024 feiringer for å få en stor gjennomsnittlig respons som kan gjøres i to opptak på 512 feier hver. Dette sikrer at responsen er stimulans fremkalt og repeterbar. I forsterkerinnstillingene til programvaren setter du forsterkningen til 100 000, low pass-filteret til 3000 Hertz og høypassfilteret til 100 Hertz.
Sett stimuluspresentasjonshastigheten mellom 10 og 20 stimuli per sekund, og tidsvarigheten for klikkstimulansen til 100 mikroseconds. Deretter setter du samplingsfrekvensen til 40 kilohertz, 25 mikroseconds for best oppløsningsdata og setter stimulanspolariseringen til vekslende. Hvis du registrerer 512-sveip, kombinerer du to separate tester for å lage et 1024 sveipegjennomsnitt, og fortsetter å registrere med lavere og lavere intensiteter til det fremkalte potensialet ikke lenger kan identifiseres.
Senk stimulansintensiteten med trinn på fem desibel lydtrykknivå for å finne den laveste stimulansintensiteten som fremkaller en fremkalt respons. Definer ABR-terskel som den laveste stimulansintensiteten som fremkaller en påviselig fremkalt respons. Etter euthanizing og decapitating dyret og eksperimentet ved å rengjøre varmeputen, rektal sonde, og sølv klorid elektroder med 70% isopropyl alkohol våtservietter, sørg for at alle ervervede spor er lagret.
Denne figuren representerer klikket ABR. Wave I peak latency økte med omtrent 0,3 millisekunder for hver 20 desibelreduksjon i stimulusintensitet. Wave I presenterte også den største toppamplituden og den laveste variabiliteten for topp latens for alle bølgeformtopper.
Grafen viser toneutbruddet fremkalt ABR. Den beste responsen ble sett på 1000 Hertz. Figuren viser at hvis kroppstemperaturen ikke opprettholdes, er latensintensitetsfunksjonene til ABR svært variable og ofte unøyaktige.
Figuren viser at ABR-er registrert fra hatchlings mindre enn tre timer gamle, merket som P1, har topp ventetider betydelig forlenget og topp amplituder redusert sammenlignet med eldre hatchlings, merket som P2. Figuren sammenligner 75 desibel lydtrykknivå klikkspor i samme dyr med forskjellige referanseelektrodeplasseringer. Wave II peak amplitude for mastoidplasseringen skjedde ett millisekund etter bølge II-toppen for nakkeplasseringen. Denne tidsforskjellen gjenspeiler sannsynligvis stedene for ABR nevral generering i forhold til elektrodeplasseringen.
Responsene mellom de to ørene var like med mindre endringer i toppamplituder sannsynligvis på grunn av øretelefonposisjonering. Ventetiden til venstre og høyre øre som tilsvarer støtter den like sunne funksjonen til både ører og hjernestammehalvdeler i klekkekyllingen. Riktig plassering av lydtransduseren kan skille mellom gode og ingen resultater.
Kyllingen ABR skal være robust med et godt signal-til-støy-forhold. Alle spørsmålene som behandles av ABR-studier i andre fuglearter, kan brukes på kyllingen. Også molekylær fysiologi forskning i embryonal kylling kan innlemme denne in vivo metodikken.
