Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door het onderzoeksproject Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) dat wordt gefinancierd door de Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research en het U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office onder subsidienummer OPP1172157.

1. Zaadaanplant
<ol><li>Kies een veldlocatie met vruchtbare, goed gedraineerde, maar geen zandgrond en met een pH van bijna 6,5. Markeer rijenpercelen van 1,2 m met een afstand van 0,75 m door de grond te scoren met een schoffel.</li>
	<li>Plant 50 zaden/m G.max cv. IA3023 op 3 cm diepte langs elk perceel aan het begin van het groeiseizoen wanneer de bodemtemperatuur tussen 25 en 30 °C ligt. OPMERKING: Met het oog op het screenen van genetische diversiteit wordt verwacht dat meerdere versc...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis:+photosynthetic+efficiency+improvement.">Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement.</a> Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).</li><li>Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+reversibility+of+photosystem+II+thermal+energy+dissipation+on+transfer+from+high+to+low+light+may+cause+large+losses+in+carbon+gain+by+crop+canopies:+a+theoretical+analysis.">The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis.</a> Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).</li><li>Kromdijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+photosynthesis+and+crop+productivity+by+accelerating+recovery+from+photoprotection.">Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection.</a> Science. 354 (6314), 857-861 (2016).</li><li>Maxwell, K., Johnson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence-a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence-a practical guide.</a> Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Murchie, E. H., Lawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+analysis:+a+guide+to+good+practice+and+understanding+some+new+applications.">Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li><li>Bilger, W., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes,+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis.">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li><li>Li, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting.">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li><li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHOTOPROTECTION+REVISITED:+genetic+and+molecular+approaches.">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin-like/&#946;-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis.">A thioredoxin-like/&#946;-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li><li>Demmig, B., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+(77K)+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants.">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li><li>Malno&#235;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis.">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li><li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

Zorgvuldige keuze en behandeling van bladschijven zijn van cruciaal belang om betrouwbare metingen van NPQ te verkrijgen. Ten eerste zal schade aan het weefsel, zoals ruwe behandeling met een pincet, stress veroorzaken, wat resulteert in lage waarden voor de maximale kwantumefficiëntie van fotosynthese. Niet-gestreste planten hebben doorgaans Fv/Fm-waarden van ongeveer 0,8318, met significante dalingen die wijzen op een afname van de fotosynthetische presta...

Fotosynthese bestaat uit lichtabsorptie, primaire elektronenoverdracht, energiestabilisatie en de synthese en het transport van fotosynthetische producten1. Het begrijpen van elke stap is van vitaal belang om de inspanningen te begeleiden om de fotosynthetische efficiëntie van het gewas te verhogen. Licht beïnvloedt de snelheid van fotosynthese, waardoor de energievoorziening in evenwicht moet worden gebracht, in de vorm van fotonen, met de vraag naar reducerende equivalenten. Wanneer het aanbod groter is dan de vraag, bijvoorbeeld bij veel licht of tijdens verminderde CO 2-fixatie veroorzaakt door stomatale sluiting, verhoogt de opbouw van reducerend vermogen de kans op de vorming van reactieve zuurstofsoorten met het potentieel om het fotosynthetische apparaat te beschadigen en het elektronentransport te belemmeren. Daarom hebben planten, om schade te voorkomen, verschillende fotobeschermende mechanismen ontwikkeld, waaronder ontgifting van reactieve zuurstofsoorten en niet-fotochemische doven van de geëxciteerde chlorofyltoestanden (NPQ)2.
Het handhaven van hoge snelheden van fotosynthese is een uitdaging onder een veldomgeving. Seizoensgebonden en dagelijkse veranderingen, samen met omgevingsfluctuaties zoals door de wind geïnduceerde bladbewegingen en voorbijgaande bewolking, veroorzaken verschuivingen in de hoeveelheid en intensiteit van het licht dat planten ontvangen voor fotosynthese3. NPQ dissipeert overtollige lichtenergie en kan helpen fotoschade te voorkomen terwijl het zorgt voor aanhoudende fotosynthese bij veel licht4. Langdurige NPQ tijdens overgangen bij hoog naar weinig licht blijft echter energie afvoeren die kan worden gebruikt voor koolstofreductie5. Als gevolg hiervan kan het versnellen van de ontspanning van NPQ de efficiëntie van fotosyntheseverhogen 6, waardoor NPQ-ontspanning een aantrekkelijk doelwit wordt voor gewasverbetering.
Pulsamplitudegemoduleerde chlorofylfluorescentie (PAM)-analyse kan worden gebruikt om NPQ te berekenen op basis van meetbare parameters (aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2)7,8,9. Dit artikel richt zich op het bepalen van NPQ-relaxatiepercentages in in het veld gekweekte planten met als doel de natuurlijke variatie in kiemplasma te screenen. PAM chlorofyl fluorometrie analyse kan echter ook worden gebruikt voor een breed scala aan doeleinden, toegepast op soorten variërend van algen tot hogere planten, en wordt elders beoordeeld 7,8,9.
In een donker aangepast blad of cel zijn de reactiecentra van fotosysteem II (PSII) open om elektronen te ontvangen en is er geen NPQ. Het inschakelen van een laag intensiteit meetlicht lokt chlorofylfluorescentie uit terwijl elektronentransport door PSII wordt vermeden. De geregistreerde minimale fluorescentie in deze aan het donker aangepaste toestand wordt beschreven door de parameter Fo. Het toepassen van een lichtpuls met hoge intensiteit op een donker aangepast blad kan snel de eerste stabiele elektronenacceptorpool van chinonen verminderen die gebonden zijn aan de chinon A-site. Dit blokkeert tijdelijk de elektronenoverdrachtscapaciteit in PSII-reactiecentra, waarvan dan wordt gezegd dat ze gesloten zijn en niet in staat zijn om elektronen te ontvangen van watersplitsing. Door gebruik te maken van een korte pulsduur is er onvoldoende tijd om NPQ te stimuleren. De resulterende chlorofylfluorescentie is gelijk aan de maximale waarde die kan worden verkregen in afwezigheid van NPQ, of maximale fluorescentie, Fm. Het verschil tussen minimale en maximale fluorescentie wordt variabele fluorescentie genoemd, Fv. De maximale fotochemische kwantumopbrengst van fotosysteem II (Fv/Fm) wordt berekend op basis van deze twee parameters met behulp van de volgende vergelijking:
Vv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Dit kan een belangrijke indicator zijn voor de functie en stress van het fotosysteem. Het inschakelen van een actinisch (fotosynthetisch) licht stimuleert niet-fotochemisch blussen, en de daaropvolgende toepassing van een verzadigingsflits maakt het mogelijk om de aan licht aangepaste maximale fluorescentie te meten, Fm'. Door het verschil tussen donkere en licht-aangepaste maximale fluorescentie te vergelijken, kan NPQ worden berekend volgens de Stern-Volmer vergelijking10:
NPQ = Vm/Vm' - 1
In hogere fabrieken is NPQ beschreven als bestaande uit ten minste vijf verschillende componenten, waaronder qE, qT, qZ, qI en qH. De precieze mechanismen die betrokken zijn bij NPQ zijn niet volledig begrepen; qE wordt echter beschouwd als het belangrijkste onderdeel van NPQ in de meeste planten. Cruciale factoren voor volledige betrokkenheid van qE zijn onder meer de opbouw van een protongradiënt over het thylakoïde membraan, de activiteit van fotosysteem II-subeenheid S11,12 en gede-epoxidateerde xanthofylen, antheraxanthine, luteïne en in het bijzonder zeaxanthine13. qE ontspant het snelst van alle NPQ-componenten (< 2 min)14, en omkeerbare activering van qE is daarom bijzonder belangrijk voor aanpassing aan verschuivende lichtintensiteiten. Een tweede langzamere fase van NPQ-ontspanning (~ 2-30 min) omvat zowel qT, gerelateerd aan toestandsovergangen, als qZ, waarbij interconversie van zeaxanthine naar violaxanthine15 betrokken is. Langzaam ontspannen (> 30 min) van NPQ kan zowel foto-inflammatoire quenching (qI)16 als processen onafhankelijk van fotoschade 17,18 omvatten, zoals qH, dat langdurig blussen in de perifere antennes van PSII gemedieerd door een plastide lipocaïn eiwit19,20.
NPQ neemt toe tijdens blootstelling aan veel licht. Daaropvolgende overdracht naar weinig licht kan resulteren in downregulatie van NPQ. Het verval van snelle, intermediaire en langzame ontspannende fasen kan worden vastgelegd in de parameters van een bi-exponentiële functie 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
De theoretische basis voor de bi-exponentiële functie is gebaseerd op de aanname van eerste-orde gebruik van hypothetische quenchers, waaronder qE (Aq1), de gecombineerde ontspanning van qZ en qT (Aq2), met de overeenkomstige tijdconstanten τq1 en τq2, en lange termijn NPQ, waaronder qI en fotoschade onafhankelijke processen (Aq3). Als zodanig biedt de bi-exponentiële functie een meer realistische weergave van de meerdere verbonden biologische processen die betrokken zijn bij het blussen van chlorofylfluorescentie in vergelijking met een eenvoudigere Hill-vergelijking die een theoretische basis mist24.
NPQ kan worden gemeten met behulp van een verscheidenheid aan in de handel verkrijgbare PAM-fluorometers25,26, van eenvoudige draagbare apparaten27 tot meer geavanceerde gesloten systemen28. Een beperking van verschillende van deze benaderingen is echter een relatief lage doorvoer, waardoor het screenen van grote collecties planten een uitdaging is zonder meerdere apparaten en een team van onderzoekers. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden McAusland et al. een procedure op basis van weggesneden bladweefsel en gebruikten deze om verschillen in chlorofylfluorescentie tussen twee tarwecultivarste identificeren 29. De aantrekkingskracht van deze aanpak is dat het afbeelden van bladschijven, genomen van meerdere planten met één apparaat, het screenen van honderden genotypen binnen een dag kan vergemakkelijken. Dit maakt het mogelijk om variatie in NPQ-relaxatie te beoordelen als onderdeel van genoombrede associatiestudies, of voor het screenen van fokpopulaties met het potentieel om de fotosynthetische efficiëntie van gewassen en uiteindelijk de opbrengst te verhogen.
Voortbouwend op de bevindingen van McAusland et al.29, gebruiken we PAM chlorofyl fluorescentie analyse van bladschijven voor high-throughput screening van NPQ relaxatiesnelheden in Glycine max (G.max; sojabonen). Dit protocol maakt gebruik van de CF Imager25, die vergelijkbaar is met andere in de handel verkrijgbare closed-PAM-systemen, zoals de populaire FluorCam26. Met een donkere ruimte voor aanpassing van monsters kunnen gebruikers 96-well platen, petrischalen en kleine planten in beeld brengen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de toename van de doorvoer die wordt geboden door het gebruik van bladschijven in vergelijking met sequentiële analyse van individuele planten. Hierin presenteren we representatieve resultaten en een methode voor het bemonsteren, meten en analyseren van NPQ in in het veld gekweekte planten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

Fotosynthese is niet geoptimaliseerd in moderne gewasvariëteiten en biedt daarom een mogelijkheid voor verbetering. Het versnellen van de ontspanning van niet-fotochemisch blussen (NPQ) is een effectieve strategie gebleken om de fotosynthetische prestaties te verhogen. Het potentieel om te fokken voor verbeterde NPQ en een volledig begrip van de genetische basis van NPQ-ontspanning ontbreekt echter vanwege beperkingen van oversampling en gegevensverzameling van in het veld gekweekte gewasplanten. Voortbouwend op eerdere rapporten presenteren we een high-throughput assay voor analyse van NPQ-relaxatiesnelheden in Glycine max (sojaboon) met behulp van pulsamplitude gemoduleerde (PAM) chlorofylfluorometrie. Bladschijven worden bemonsterd van in het veld gekweekte sojabonen voordat ze naar een laboratorium worden vervoerd waar NPQ-relaxatie wordt gemeten in een gesloten PAM-fluorometer. NPQ-relaxatieparameters worden berekend door een bi-exponentiële functie toe te passen op de gemeten NPQ-waarden na een overgang van hoog naar weinig licht. Met behulp van deze methode is het mogelijk om binnen een dag honderden genotypen te testen. De procedure heeft het potentieel om mutanten- en diversiteitspanels te screenen op variatie in NPQ-relaxatie en kan daarom worden toegepast op zowel fundamentele als toegepaste onderzoeksvragen.

Figuur 1A toont een typische meting van NPQ in in het veld geteelde sojabonen. Planten werden gekweekt in Urbana, IL (breedtegraad 40.084604 °, lengtegraad -88.227952 °) in de zomer van 2021, met zaden geplant op 5 juni. 2021. De bladschijven zijn na 30 dagen zaadjes planten bemonsterd en er zijn metingen verricht met het bijgeleverde protocol (tabel 1). Fv/Fm - en NPQ-waarden werden berekend voor elke bladschijf (aanvullende tabel 4) en ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Het protocol introduceert een high-throughput methode voor het meten van de ontspanning van niet-fotochemische quenching door pulsamplitude gemoduleerde chlorofyl fluorometrie. De methode wordt toegepast op in het veld gekweekte Glycine max en kan worden aangepast aan andere soorten om te screenen op genetische diversiteit of broedpopulaties.

High-Throughput analyse van niet-fotochemische blussing in gewassen met behulp van pulsamplitude gemoduleerde chlorofylfluorometrie

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Deze methode kan inzicht geven in de genetische variatie in niet-fotochemische blussing die beschikbaar is binnen genetische diversiteitspanels of broedpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het potentieel om een groot aantal genotypen binnen één dag te screenen op variatie in niet-fotochemische blussing. Het protocol wordt gepresenteerd voor glycine max of sojabonen, maar kan worden aangepast om andere plantenruimtes te analyseren waaruit liftschijven kunnen worden verzameld.Voor iemand die het protocol voor de eerste keer uitvoert, is de sleutel het hanteren van de liftschijf om schade of oververzadigde sponzen met water te voorkomen. Om te beginnen, bemonster de planten op de veldlocatie 30 dagen na ontkieming. Vul 1/3-niveau gedestilleerd water in alle putten van een 24-well plaat.Label het deksel en de zijkant van de plaat met de te bemonsteren replica's. Houd het jongste volledig geëxpandeerde blad dat aan de bovenkant van de plant aanwezig is tegen een rubberen stop. Druk een nummer twee Humboldt kurkboorder door het blad en draai om een schijf te snijden, waarbij de middenrib wordt vermeden.Verzamel achtereenvolgens vijf schijven van hetzelfde blad voor technische replicaties. Duw de bladschijven uit de kurkboorder in een enkele put van een 24-wells plaat met behulp van een wattenstaafje en herhaal dit voor een andere plant van hetzelfde genotype. Controleer of alle bladschijven in het water drijven.Zo niet, beweeg dan voorzichtig bladschijven die aan de zijkant van een put kleven in een zwevende positie met een wattenstaafje. Ga verder met bemonsteringsschijven uit de volgende plot. Plaats het deksel en sluit af met een semi-transparante flexibele folie.na het voltooien van de bemonstering in de gehele 24-well plaat. Bewaar het bord uit direct zonlicht in een zak, doos of lege koeler. Tik in een schone laboratoriumruimte op het deksel van de verzegelde plaat om bladschijven los te maken die tijdens het transport aan het deksel zijn vastgeplakt.Pak de film uit en verwijder het deksel. Breng een bladschijf van de eerste positie van de 24-well plaat over in een verse 96-well plaat met de bladschijf plat naar beneden gericht op de bodem van de put. Snijd een neusaspiratorfilter doormidden.Dompel het resulterende filter halverwege in water en dep op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats het filter in de put met de bladschijf om de luchtvochtigheid op peil te houden. Neem een tweede bladschijf vanaf de eerste positie van de 24-well plaat en plaats deze met de voorkant naar beneden in de volgende beschikbare positie van de 96-well plaat.Dompel de resterende helft van het geproduceerde neusfilter in water en dep het op een papieren handdoek voordat u het met de tweede bladschijf in de put steekt. Plak de rechterbovenhoek vast om de plaat in het donker te oriënteren voor beeldvorming. Sluit platen af met een semi-transparante flexibele film en wikkel de plaat in aluminiumfolie.Schrijf de plot-ID's en plaat-ID op de aluminiumfolie. Plaats platen in een donkere doos of kast gedurende minimaal 30 minuten voor de ontspanning van de eerste twee fasen van niet-fotochemisch blussen. Gebruik een langdurige donkere incubatietijd van een uur voor beeldvorming als langdurige fasen van niet-fotochemische blussing van belang zijn.Bereid een extra dummyplaat voor om tijdens de analyse scherp te stellen door een bladschijf in elke hoek van een verse 96-well plaat en een in het midden te plaatsen. Beveilig bladschijven met neusfilters zoals gedaan met eerdere platen, sluit de plaat af en incubeer in het donker bij kamertemperatuur en 50% relatieve vochtigheid. Schakel de imager in en open de imaging software.Klik op Instellingen gevolgd door Protocol om een venster te openen voor het invoeren van stappen in het PAM experimentele protocol. Stel de technische specificaties van de machine in het manuscript in. Stel het programma in om te beginnen met een verzadigingspuls om de maximale kwantumefficiëntie van donker-aangepaste fotosynthese te meten door 20 seconden in te voeren in het vak met de naam After a delay of.Klik op het vak Puls toepassen en voer 1 in het vak met de titel Dit aantal keren in. Stel de puls PPFD in op 6, 152, de pulslengte op 800 milliseconden en vink het vakje aan Neem F prime- en FM-prime-beelden met alle pulsen. Schakel Invoegen na in om een tweede stap aan het protocol toe te voegen.Voer 30 seconden in het vak met de titel Na een vertraging van in. Selecteer vervolgens de optie Actinic wijzigen en voer 50 in het vak met de titel Actinic PPFD in om de lichtintensiteit in de kamer in te stellen op 50 PPFD. Klik op Invoegen na om een nieuwe stap aan het protocol toe te voegen en voer 150 seconden in het vak met de titel Na een vertraging van in.Selecteer Puls toepassen en voer 4 in het vak Dit aantal keren om meetpulsen om de 150 seconden vier keer achter elkaar toe te passen terwijl het actinische licht op 50 PPFD wordt gehouden. Pas de vertraging en lichtintensiteit voor elke stap aan volgens de waarden in het manuscript voordat u het protocol opslaat als een pcl-bestand op de gewenste locatie. Doe het licht uit en plaats de dummyplaat met de voorkant naar beneden op het monstertrap, zodat het adaxiale oppervlak van het blad naar de detector wijst en de spons naar beneden naar het platform is gericht.Stel de hoogte van het monstertrapsysteem zo in dat de bladschijven zich 140 millimeter boven de basis van het instrument bevinden. Klik op het pictogram Verbinden/loskoppelen van de camera en de hardwarecamera om de camera te starten. Klik op het focusfluorescentiesymbool, dat wordt weergegeven door een roodgekleurd, tweezijdig pijlpictogram met twee groene lijnen aan de basis, en pas de lens en belichting aan om de plaat scherp te stellen.Klik nogmaals op het focusfluorescentiepictogram om het knipperende lampje uit te schakelen. Werk in het donker en vervang de dummyplaat door de te analyseren plaat. Plaats het met de voorkant naar beneden met de tape aan de buitenkant die wordt gebruikt om de rechterbovenhoek te oriënteren en klik op het pictogram van de kaartafbeeldingscamera.Pas de beeldbelichting aan door het diafragma te openen of te sluiten totdat de balk in het pop-upvenster in de groene zone is geplaatst. Klik op de knop Opnieuw proberen na elke aanpassing van het diafragma totdat de belichting correct is aangepast en het instrument een opname maakt. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Afbeeldingsisolatie toepassen om achtergrondsignalen te blokkeren.Het gefocuste bladgebied wordt grijs weergegeven en de achtergrond blauw. Selecteer het gebied of de pixels die u wilt gebruiken om alleen de bladschijven op te nemen door het histogram- en gammaniveau aan te passen in het vervolgkeuzemenu Afbeelding wijzigen door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Hoge en lage delen verwijderen om de lichtblauw gemarkeerde gebieden te verwijderen.Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Afdwalen verwijderen om alle pixels te verwijderen die de laatste drie andere pixels niet raken. Alle gebieden op de afbeelding die als geïsoleerde eilanden worden weergegeven, worden afzonderlijk geanalyseerd en opgenomen in de uiteindelijke gegevensuitvoer. Klik op het pictogram Protocol uitvoeren om het programma te starten.Er verschijnt een timer onder aan het scherm die u informeert hoe lang het protocol nog moet worden uitgevoerd. Wacht tot het protocol klaar is. Klik op Bestand en Opslaan als om de gegevens op te slaan als een iGR-bestand.Sluit het venster door op het rode kruis in de rechterbovenhoek van het venster te klikken voordat u een andere monsterplaat start. Om de chlorofylfluorescentiegegevens te exporteren, opent u het igr-bestand in de beeldbewerkingssoftware en klikt u op Bestand gevolgd door Exporteren naar map om een nieuwe map met alle benodigde bestanden te maken. Een typische meting van niet-fotochemische blussing in in het veld gekweekte sojabonen toonde aan dat na een eerste verzadigingsflits om Fv / Fm te bepalen wanneer de bladschijven werden blootgesteld aan weinig licht van 50 micromol per meter per seconde, de niet-fotochemische blusbeurt minder dan één was.Bovendien nam bij overdracht naar hoog licht van 2.000 micromol per meter per seconde het niet-fotochemische blussen na 15 minuten toe tot de maximale waarde van vier. Een mislukte meting toonde een minimale toename van niet-fotochemische blussing bij overdracht naar hoog licht. Het oriënteren van platen in de imager en een duidelijk gedefinieerd plan voor het bemonsteren en plateren van bladschijven is essentieel om ervoor te zorgen dat de gegevens zijn gekoppeld aan het juiste genotype.Dit protocol kan de impact van omgevingsvariabelen zoals droogte en afstoten op niet-fotochemische blussen kwantificeren of niet-fotochemische blussen op verschillende canopy-niveaus evalueren om gewasmodellen te verfijnen.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Ontwikkeling van methoden voor gentransformatie en bewerking in bamboe

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Auteur in de schijnwerpers: het bevorderen van genbewerking in bamboebladeren voor duurzame plastic alternatieven 

In Planta Genexpressie en genbewerking in Moso Bamboo Leaves

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...