Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

Ce travail est soutenu par le projet de recherche Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) financé par la Fondation Bill & Melinda Gates, la Foundation for Food and Agriculture Research et le Foreign, Commonwealth & Development Office du Royaume-Uni sous le numéro de subvention OPP1172157.

1. Plantation de semences
<ol><li>Choisissez un site de champ avec un sol fertile, bien drainé, mais pas sablonneux, et avec un pH de près de 6,5. Marquez les parcelles en rangée de 1,2 m avec un espacement de 0,75 m en marquant le sol avec une houe.</li>
	<li>Plantez 50 graines/m de G.max cv. IA3023 à 3 cm de profondeur le long de chaque parcelle au début de la saison de croissance lorsque les températures du sol sont comprises entre 25 et 30 °C. REMARQUE: Aux fins du dépistage de ...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence-a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence-a practical guide.</a> Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Murchie, E. H., Lawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+analysis:+a+guide+to+good+practice+and+understanding+some+new+applications.">Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li><li>Bilger, W., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes,+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis.">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li><li>Li, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting.">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li><li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHOTOPROTECTION+REVISITED:+genetic+and+molecular+approaches.">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin-like/&#946;-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis.">A thioredoxin-like/&#946;-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li><li>Demmig, B., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+(77K)+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants.">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li><li>Malno&#235;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis.">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li><li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

Un choix et une manipulation minutieux des disques de feuilles sont essentiels pour obtenir des mesures fiables du NPQ. Tout d’abord, les dommages aux tissus, tels qu’une manipulation brutale avec une pince à épiler, introduiront un stress, ce qui entraînera de faibles valeurs pour l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse. Les plantes non stressées ont généralement des valeurs Fv/Fm d’environ 0,8318, avec des baisses significatives...

La photosynthèse consiste en l’absorption de la lumière, le transfert d’électrons primaires, la stabilisation de l’énergie, ainsi que la synthèse et le transport de produits photosynthétiques1. Comprendre chaque étape est essentiel pour guider les efforts visant à augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures. La lumière affecte le taux de photosynthèse, nécessitant un apport énergétique d’équilibrage, sous forme de photons, avec une demande d’équivalents réducteurs. Lorsque l’offre dépasse la demande, par exemple sous haute lumière ou lors d’une fixation réduite du CO2 causée par la fermeture stomatique, l’accumulation de puissance réductrice augmente la probabilité de formation d’espèces réactives de l’oxygène susceptibles d’endommager l’appareil photosynthétique et d’entraver le transport des électrons. Par conséquent, pour prévenir les dommages, les plantes ont développé plusieurs mécanismes photoprotecteurs, y compris la désintoxication des espèces réactives de l’oxygène et la trempe non photochimique des états chlorophylliens excités (NPQ)2.
Maintenir des taux élevés de photosynthèse est difficile dans un environnement de terrain. Les changements saisonniers et diurnes, ainsi que les fluctuations environnementales telles que les mouvements des feuilles induits par le vent et la couverture nuageuse transitoire, provoquent des changements dans la quantité et l’intensité de la lumière reçue par les plantes pour la photosynthèse3. Le NPQ dissipe l’excès d’énergie lumineuse et peut aider à prévenir les photo-dommages tout en permettant des taux soutenus de photosynthèse à haute luminosité4. Cependant, le NPQ prolongé pendant les transitions de lumière élevée à faible luminosité continue de dissiper l’énergie qui pourrait être utilisée pour la réduction du carbone5. En conséquence, accélérer la relaxation du NPQ peut augmenter l’efficacité de la photosynthèse6, faisant de la relaxation du NPQ une cible attrayante pour l’amélioration des cultures.
L’analyse de fluorescence de la chlorophylle (PAM) modulée en amplitude d’impulsion (PAM) peut être utilisée pour calculer le NPQ à partir de paramètres mesurables (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2)7,8,9. Cet article se concentre sur la détermination des taux de relaxation du NPQ chez les plantes cultivées en plein champ dans le but de dépister la variation naturelle du matériel génétique. Cependant, l’analyse de la fluorométrie de la chlorophylle PAM peut également être utilisée à des fins très diverses, appliquée à des espèces allant des algues aux plantes supérieures, et est examinée ailleurs 7,8,9.
Dans une feuille ou une cellule adaptée à l’obscurité, les centres de réaction du photosystème II (PSII) sont ouverts pour recevoir des électrons et il n’y a pas de NPQ. L’allumage d’une lumière de mesure de faible intensité provoque une fluorescence de la chlorophylle tout en évitant le transport d’électrons à travers PSII. La fluorescence minimale enregistrée dans cet état adapté à l’obscurité est décrite par le paramètre Fo. L’application d’une impulsion lumineuse de haute intensité à une feuille adaptée à l’obscurité peut rapidement réduire le premier pool d’accepteurs d’électrons stables de quinones liés au site de la quinone A. Cela bloque temporairement la capacité de transfert d’électrons dans les centres de réaction PSII, qui sont alors dits fermés et incapables de recevoir des électrons de la division de l’eau. En utilisant une courte durée d’impulsion, il n’y a pas assez de temps pour stimuler le NPQ. La fluorescence chlorophyllienne résultante est équivalente à la valeur maximale pouvant être obtenue en l’absence de NPQ, ou fluorescence maximale, Fm. La différence entre la fluorescence minimale et la fluorescence maximale est appelée fluorescence variable, Fv. Le rendement quantique photochimique maximal du photosystème II (Fv/Fm) est calculé à partir de ces deux paramètres à l’aide de l’équation suivante :
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Cela peut fournir un indicateur important de la fonction du photosystème et du stress. L’allumage d’une lumière actinique (photosynthétique) stimule la trempe non photochimique, et l’application ultérieure d’un flash saturant permet de mesurer la fluorescence maximale adaptée à la lumière, F m'. En comparant la différence entre la fluorescence maximale sombre et la fluorescence maximale adaptée à la lumière, le NPQ peut être calculé selon l’équation de Stern-Volmer10 :
NPQ = Fm/Fm' - 1
Dans les usines supérieures, le NPQ a été décrit comme composé d’au moins cinq composants distincts, notamment qE, qT, qZ, qI et qH. Les mécanismes précis impliqués dans le NPQ ne sont pas entièrement compris; cependant, le qE est considéré comme le principal composant du NPQ dans la plupart des usines. Des facteurs cruciaux pour un engagement complet de l’QE comprennent l’accumulation d’un gradient de protons à travers la membrane thylakoïde, l’activité de la sous-unité S11,12 du photosystème II et les xanthophylles époxydées, l’anthéroaxanthine, la lutéine et en particulier la zéaxanthine13. Le qE se détend le plus rapidement de tous les composants NPQ (< 2 min)14, et l’activation réversible du qE est donc particulièrement importante pour l’adaptation aux intensités lumineuses changeantes. Une deuxième phase plus lente de relaxation NPQ (~2-30 min) englobe à la fois qT, liée aux transitions d’état, et qZ, impliquant l’interconversion de la zéaxanthine en violaxanthine15. La relaxation lente (> 30 min) de NPQ peut inclure à la fois une trempe photoinhibitoire (qI)16 et des processus indépendants des photodommages17,18, tels que qH, qui est une trempe soutenue dans les antennes périphériques du PSII médiée par une protéine de lipocaline plaste19,20.
NPQ augmente pendant l’exposition à la lumière élevée. Le transfert ultérieur à une faible luminosité peut entraîner une régulation négative du NPQ. La désintégration des phases de relaxation rapides, intermédiaires et lentes peut être capturée dans les paramètres d’une fonction bi-exponentielle 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
La base théorique de la fonction bi-exponentielle est basée sur l’hypothèse de l’utilisation de premier ordre de quenchers hypothétiques, y compris qE (Aq1), la relaxation combinée de qZ et qT (Aq2), avec les constantes de temps correspondantes τq1 et τq2, et NPQ à long terme, qui comprend qI et des processus indépendants de photodommages (Aq3). En tant que telle, la fonction bi-exponentielle fournit une représentation plus réaliste des multiples processus biologiques connectés impliqués dans l’extinction de la fluorescence de la chlorophylle par rapport à une équation de Hill plus simple qui manque d’une base théorique24.
Le NPQ peut être mesuré à l’aide d’une variété de fluoromètres PAM25,26 disponibles dans le commerce, des simples appareils portatifs27 aux systèmes fermés plus avancés28. Cependant, une limitation de plusieurs de ces approches est un débit relativement faible, ce qui rend difficile le criblage de grandes collections de plantes sans plusieurs dispositifs et une équipe de chercheurs. Pour résoudre ce problème, McAusland et al. ont développé une procédure basée sur le tissu foliaire excisé et l’ont utilisée pour identifier les différences de fluorescence de la chlorophylle entre deux cultivars de blé29. L’attrait de cette approche est que l’imagerie des disques de feuilles, prélevés sur plusieurs plantes avec un seul appareil, peut faciliter le dépistage de centaines de génotypes en une journée. Cela permet d’évaluer la variation de la relaxation du NPQ dans le cadre d’études d’association à l’échelle du génome, ou de dépister les populations reproductrices ayant le potentiel d’augmenter l’efficacité photosynthétique des cultures et, en fin de compte, le rendement.
En nous appuyant sur les résultats de McAusland et al.29, nous utilisons l’analyse de fluorescence de la chlorophylle PAM des disques foliaires pour le criblage à haut débit des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (G.max; soja). Ce protocole utilise le CF Imager25, qui est comparable à d’autres systèmes PAM fermés disponibles dans le commerce, tels que le populaire FluorCam26. Avec une pièce sombre pour l’adaptation des échantillons, les utilisateurs peuvent imager des assiettes à 96 puits, des boîtes de Petri et de petites plantes. Le principal avantage de cette approche est l’augmentation du débit offerte par l’utilisation de disques de feuilles par rapport à l’analyse séquentielle de plantes individuelles. Nous présentons ici des résultats représentatifs et une méthode d’échantillonnage, de mesure et d’analyse du NPQ dans les plantes cultivées en plein champ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

La photosynthèse n’est pas optimisée dans les variétés de cultures modernes et offre donc une opportunité d’amélioration. Accélérer la relaxation de la trempe non photochimique (NPQ) s’est avéré être une stratégie efficace pour augmenter les performances photosynthétiques. Cependant, le potentiel de sélection pour améliorer le NPQ et une compréhension complète de la base génétique de la relaxation du NPQ font défaut en raison des limites du suréchantillonnage et de la collecte de données à partir de plantes cultivées en plein champ. En nous appuyant sur des rapports précédents, nous présentons un test à haut débit pour l’analyse des taux de relaxation NPQ dans Glycine max (soja) en utilisant la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion (PAM). Les disques de feuilles sont échantillonnés à partir de soja cultivé en plein champ avant d’être transportés vers un laboratoire où la relaxation du NPQ est mesurée dans un fluoromètre PAM fermé. Les paramètres de relaxation NPQ sont calculés en adaptant une fonction bi-exponentielle aux valeurs NPQ mesurées après une transition de la lumière haute à la lumière faible. En utilisant cette méthode, il est possible de tester des centaines de génotypes en une journée. La procédure a le potentiel de filtrer les panels mutants et de diversité pour la variation de la relaxation NPQ, et peut donc être appliquée à des questions de recherche fondamentale et appliquée.

La figure 1A illustre une mesure typique du NPQ dans le soja cultivé en plein champ. Les plantes ont été cultivées à Urbana, IL (latitude 40.084604°, longitude -88.227952°) au cours de l’été 2021, avec des graines plantées le 5 juin. 2021. Les disques de feuilles ont été échantillonnés après 30 jours de plantation de semences, et des mesures ont été effectuées avec le protocole fourni (tableau 1). Les valeurs Fv/Fm et NPQ ont été calcu...

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High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Le protocole introduit une méthode à haut débit pour mesurer la relaxation de la trempe non photochimique par fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion. La méthode est appliquée à Glycine max cultivée en plein champ et peut être adaptée à d’autres espèces pour dépister la diversité génétique ou les populations reproductrices.

Analyse à haut débit de la trempe non photochimique dans les cultures à l’aide de la fluorométrie de chlorophylle modulée en amplitude d’impulsion

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Cette méthode peut donner un aperçu de la variation génétique de la trempe non photochimique disponible au sein des panels de diversité génétique ou des populations reproductrices. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de dépister un grand nombre de génotypes pour la variation de la trempe non photochimique en une seule journée. Le protocole est présenté pour la glycine max ou le soja, mais peut être adapté pour analyser d’autres espaces végétaux à partir desquels des disques de levage peuvent être collectés.Pour quelqu’un qui exécute le protocole pour la première fois, la clé est de manipuler le disque de levage pour éviter d’endommager ou de sursaturer les éponges avec de l’eau. Pour commencer, échantillonnez les plantes sur le site du champ 30 jours après la germination. Remplir 1/3 niveau d’eau distillée dans tous les puits d’une plaque de 24 puits.Étiquetez le couvercle et le côté de la plaque avec les répliques à échantillonner. Tenez la plus jeune feuille entièrement expansée présente au sommet de la plante contre un bouchon en caoutchouc. Appuyez sur un foreur de liège Humboldt numéro deux à travers la feuille et tournez pour couper un disque, en évitant la côte médiane.Collectez consécutivement cinq disques de la même feuille pour des répliques techniques. Poussez les disques de feuilles hors de l’agrile du liège dans un seul puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’un coton-tige et répétez ceci pour une autre plante du même génotype. Vérifiez que tous les disques de feuilles flottent dans l’eau.Sinon, déplacez doucement les disques de feuilles collés sur le côté d’un puits en position flottante avec un coton-tige. Passez aux disques d’échantillonnage du tracé suivant. Placez le couvercle et scellez avec un film flexible semi-transparent.après avoir terminé l’échantillonnage dans toute la plaque de 24 puits. Conservez l’assiette à l’abri de la lumière directe du soleil dans un sac, une boîte ou une glacière vide. Dans un espace de laboratoire propre, tapotez le couvercle de la plaque scellée pour déloger les disques de feuilles collés au couvercle pendant le transport.Déballez le film et retirez le couvercle. Transférez un disque de feuilles de la première position de la plaque de 24 puits dans une plaque fraîche de 96 puits avec le disque de feuilles tourné vers le bas au fond du puits. Coupez un filtre d’aspirateur nasal en deux.Trempez le filtre résultant à mi-chemin dans l’eau et tamponnez sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide. Insérez le filtre dans le puits avec le disque de feuille pour maintenir l’humidité. Prenez un deuxième disque de feuilles à partir de la première position de la plaque de 24 puits et placez-le face vers le bas dans la position disponible suivante de la plaque de 96 puits.Trempez la moitié restante du filtre nasal produit dans de l’eau et tamponnez-la sur une serviette en papier avant de l’insérer dans le puits avec le deuxième disque de feuilles. Collez le coin supérieur droit pour aider à orienter la plaque dans l’obscurité pour l’imagerie. Scellez les plaques avec un film flexible semi-transparent et enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium.Écrivez les ID de tracé et l’ID de plaque sur la feuille d’aluminium. Placez les plaques dans une boîte ou une armoire sombre pendant au moins 30 minutes pour la relaxation des deux premières phases de trempe non photochimique. Utilisez une période d’incubation sombre prolongée d’une heure avant l’imagerie si des phases à long terme de trempe non photochimique sont intéressantes.Préparez une plaque factice supplémentaire pour la mise au point pendant l’analyse en plaçant un disque de feuille dans chaque coin d’une plaque fraîche de 96 puits et un au centre. Fixez les disques de feuilles avec des filtres nasaux comme avec les plaques précédentes, scellez la plaque et incubez dans l’obscurité à température ambiante et à 50% d’humidité relative. Allumez l’imageur et ouvrez le logiciel d’imagerie.Cliquez sur Paramètres suivis de Protocole pour ouvrir une fenêtre pour la saisie des étapes dans le protocole expérimental PAM. Définissez les spécifications techniques de la machine fournie dans le manuscrit. Réglez le programme pour qu’il commence par une impulsion saturante pour mesurer l’efficacité quantique maximale de la photosynthèse adaptée à l’obscurité en entrant 20 secondes dans la boîte nommée Après un délai de.Cliquez sur la case Appliquer l’impulsion et entrez 1 dans la zone intitulée Ce nombre de fois. Réglez l’impulsion PPFD sur 6 152, la longueur d’impulsion sur 800 millisecondes, et cochez la case Prendre des images F prime et FM prime avec toutes les impulsions. Cochez insérer après pour ajouter une deuxième étape au protocole.Entrez 30 secondes dans la case intitulée Après un délai de. Ensuite, sélectionnez l’option Changer actinique et entrez 50 dans la case intitulée Actinic PPFD pour régler l’intensité lumineuse de la chambre sur 50 PPFD. Cliquez sur Insérer après pour ajouter une nouvelle étape au protocole et entrez 150 secondes dans la zone intitulée Après un délai de.Sélectionnez Appliquer l’impulsion et entrez 4 dans la case intitulée Ce nombre de fois pour appliquer des impulsions de mesure toutes les 150 secondes quatre fois de suite pendant que la lumière actinique est maintenue à 50 PPFD. Ajustez le délai et l’intensité lumineuse pour chaque étape en fonction des valeurs fournies dans le manuscrit avant d’enregistrer le protocole sous forme de fichier pcl à l’emplacement souhaité. Éteignez la lumière et placez la plaque factice face cachée sur la scène d’échantillonnage de sorte que la surface adaxiale de la feuille pointe vers le haut vers le détecteur et que l’éponge soit orientée vers le bas vers la plate-forme.Réglez la hauteur de la scène d’échantillonnage de sorte que les disques de feuilles soient à 140 millimètres au-dessus de la base de l’instrument. Cliquez sur l’icône Se connecter/déconnecter à l’appareil photo imageur et à l’appareil photo matériel pour démarrer l’appareil photo. Cliquez sur le symbole de fluorescence de mise au point, représenté par une icône de flèche à deux côtés de couleur rouge avec deux lignes vertes à la base, puis ajustez l’objectif et l’exposition pour mettre la plaque au point.Cliquez à nouveau sur l’icône de fluorescence de mise au point pour éteindre la lumière clignotante. En travaillant dans l’obscurité, remplacez la plaque factice par la plaque à analyser. Placez-le face vers le bas avec le ruban adhésif à l’extérieur utilisé pour orienter le coin supérieur droit et cliquez sur l’icône de la caméra d’image de carte.Réglez l’exposition de l’image en ouvrant ou en fermant l’ouverture jusqu’à ce que la barre de la fenêtre contextuelle soit positionnée dans la zone verte. Cliquez sur le bouton Réessayer après chaque réglage de l’ouverture jusqu’à ce que l’exposition soit correctement ajustée et que l’instrument prenne une image. Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Appliquer l’isolation de l’image pour bloquer les signaux d’arrière-plan.La zone foliaire focalisée sera affichée en gris et l’arrière-plan en bleu. Sélectionnez la zone ou les pixels d’intérêt pour inclure uniquement les disques de feuilles en ajustant l’histogramme et le niveau gamma dans le menu déroulant Modifier l’image en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image. Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Supprimer les coupes hautes et basses pour supprimer les zones surlignées bleu clair.Faites un clic droit sur l’image et sélectionnez Supprimer les pixels parasites pour supprimer tous les pixels qui ne touchent pas les trois derniers autres pixels. Toutes les zones de l’image qui apparaissent comme des îles isolées seront analysées séparément et incluses dans la sortie finale des données. Cliquez sur l’icône Exécuter le protocole pour démarrer le programme.Une minuterie apparaîtra en bas de l’écran pour vous informer du temps qu’il reste au protocole pour s’exécuter. Attendez que le protocole soit terminé. Cliquez sur Fichier et Enregistrer sous pour enregistrer les données en tant que fichier igr.Fermez la fenêtre en cliquant sur la croix rouge en haut à droite de la fenêtre avant de commencer une autre plaque d’échantillonnage. Pour exporter les données de fluorescence de la chlorophylle, ouvrez le fichier igr dans le logiciel d’imagerie et cliquez sur Fichier suivi de Exporter vers le dossier pour créer un nouveau dossier avec tous les fichiers nécessaires. Une mesure typique de la trempe non photochimique dans le soja cultivé en plein champ a montré qu’après un éclair de saturation initial pour déterminer Fv / Fm lorsque les disques foliaires étaient exposés à une faible lumière de 50 micromoles par mètre et par seconde, la trempe non photochimique était inférieure à un.De plus, lors du transfert à une lumière élevée de 2 000 micromoles par mètre et par seconde, la trempe non photochimique a augmenté jusqu’à la valeur maximale de quatre après 15 minutes. Une mesure échouée a montré une augmentation minime de la trempe non photochimique lors du transfert en haute lumière. Des plaques d’orientation à l’intérieur de l’imageur et un plan clairement défini pour l’échantillonnage et le placage des disques de feuilles sont essentiels pour s’assurer que les données sont liées au génotype correct.Ce protocole peut quantifier l’impact de variables environnementales telles que la sécheresse et l’excrétion sur la trempe non photochimique ou évaluer la trempe non photochimique à différents niveaux de la canopée pour affiner les modèles de culture.

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JoVE Journal

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