Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal progetto di ricerca Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) finanziato dalla Bill & Melinda Gates Foundation, foundation for Food and Agriculture Research e dal Foreign, Commonwealth & Development Office del Regno Unito con il numero di sovvenzione OPP1172157.

1. Semina
<ol><li>Scegli un sito sul campo con terreno fertile, ben drenato, ma non sabbioso e con un pH di quasi 6,5. Segna i lotti di fila da 1,2 m con una spaziatura di 0,75 m segnando il terreno con una zappa.</li>
	<li>Piantare 50 semi/m di G.max cv. IA3023 a 3 cm di profondità lungo ogni appezzamento all'inizio della stagione di crescita quando le temperature del suolo sono comprese tra 25 e 30 °C. NOTA: Ai fini dello screening della diversità genetica, si prevede che vengano colti...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li><li>Bilger, W., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes,+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis.">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li><li>Li, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting.">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li><li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHOTOPROTECTION+REVISITED:+genetic+and+molecular+approaches.">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin-like/&#946;-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis.">A thioredoxin-like/&#946;-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li><li>Demmig, B., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+(77K)+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants.">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li><li>Malno&#235;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis.">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li><li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

La scelta accurata e la gestione dei dischi fogliari sono fondamentali per ottenere misurazioni affidabili di NPQ. In primo luogo, i danni al tessuto, come la manipolazione approssimativa con una pinzetta, introdurranno stress, con conseguenti valori bassi per la massima efficienza quantistica della fotosintesi. Le piante non stressate hanno tipicamente valori Fv/Fm di circa 0,8318, con cali significativi che indicano una riduzione delle prestazioni fotosint...

La fotosintesi consiste nell'assorbimento della luce, nel trasferimento di elettroni primari, nella stabilizzazione dell'energia e nella sintesi e trasporto di prodotti fotosintetici1. Comprendere ogni passaggio è fondamentale per guidare gli sforzi per aumentare l'efficienza fotosintetica delle colture. La luce influenza il tasso di fotosintesi, richiedendo un apporto energetico di bilanciamento, sotto forma di fotoni, con la domanda di equivalenti riducenti. Quando l'offerta supera la domanda, ad esempio in condizioni di luce intensa o durante la ridotta fissazione di CO2 causata dalla chiusura stomatica, l'accumulo di potenza riducente aumenta la probabilità di formazione di specie reattive dell'ossigeno con il potenziale di danneggiare l'apparato fotosintetico e compromettere il trasporto di elettroni. Pertanto, per prevenire danni, le piante hanno sviluppato diversi meccanismi fotoprotettivi, tra cui la disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno e la tempra non fotochimica degli stati eccitati della clorofilla (NPQ)2.
Mantenere alti tassi di fotosintesi è difficile in un ambiente di campo. I cambiamenti stagionali e diurni, insieme alle fluttuazioni ambientali come i movimenti fogliari indotti dal vento e la copertura nuvolosa transitoria, causano cambiamenti nella quantità e nell'intensità della luce ricevuta dalle piante per la fotosintesi3. NPQ dissipa l'energia luminosa in eccesso e può aiutare a prevenire i foto-danni, consentendo al contempo tassi sostenuti di fotosintesi ad alta luminosità4. Tuttavia, l'NPQ prolungato durante le transizioni da alta a bassa illuminazione continua a dissipare l'energia che potrebbe essere utilizzata per la riduzione del carbonio5. Di conseguenza, accelerare il rilassamento di NPQ può aumentare l'efficienza della fotosintesi6, rendendo il rilassamento NPQ un obiettivo attraente per il miglioramento delle colture.
L'analisi di fluorescenza della clorofilla modulata in ampiezza di impulso (PAM) può essere utilizzata per calcolare NPQ da parametri misurabili (Tabella supplementare 1 e Tabella supplementare 2)7,8,9. Questo articolo si concentra sulla determinazione dei tassi di rilassamento NPQ nelle piante coltivate sul campo allo scopo di vagliare la variazione naturale del germoplasma. Tuttavia, l'analisi fluorometrica della clorofilla PAM può anche essere utilizzata per un'ampia varietà di scopi, applicata a specie che vanno dalle alghe alle piante superiori, ed è rivista altrove 7,8,9.
In una foglia o cellula adattata al buio, i centri di reazione del fotosistema II (PSII) sono aperti per ricevere elettroni e non c'è NPQ. L'accensione di una luce di misurazione a bassa intensità provoca la fluorescenza della clorofilla evitando il trasporto di elettroni attraverso PSII. La fluorescenza minima registrata in questo stato adattato al buio è descritta dal parametro Fo. L'applicazione di un impulso luminoso ad alta intensità a una foglia adattata al buio può ridurre rapidamente il primo pool stabile di accettori di elettroni legati al sito A del chinone. Questo blocca temporaneamente la capacità di trasferimento di elettroni nei centri di reazione PSII, che si dice siano chiusi e incapaci di ricevere elettroni dalla scissione dell'acqua. Utilizzando una breve durata dell'impulso, non c'è tempo sufficiente per stimolare NPQ. La fluorescenza della clorofilla risultante è equivalente al valore massimo ottenibile in assenza di NPQ, o fluorescenza massima, Fm. La differenza tra fluorescenza minima e massima è indicata come fluorescenza variabile, Fv. La resa quantistica fotochimica massima del fotosistema II (Fv/Fm) è calcolata da questi due parametri utilizzando la seguente equazione:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Questo può fornire un importante indicatore della funzione del fotosistema e dello stress. L'accensione di una luce attinica (fotosintetica) stimola la tempra non fotochimica e la successiva applicazione di un flash saturante consente la misurazione della fluorescenza massima adattata alla luce, Fm'. Confrontando la differenza tra fluorescenza massima scura e adattata alla luce, nPQ può essere calcolato secondo l'equazione di Stern-Volmer10:
NPQ = Fm/Fm' - 1
Negli impianti superiori, nPQ è stato descritto come costituito da almeno cinque componenti distinti, tra cui qE, qT, qZ, qI e qH. I meccanismi precisi coinvolti nella NPQ non sono completamente compresi; tuttavia, il qE è considerato il componente principale di NPQ nella maggior parte degli impianti. Fattori cruciali per il pieno coinvolgimento della qE sono stati trovati per includere l'accumulo di un gradiente protonico attraverso la membrana tilacoide, l'attività della subunità S11,12 del fotosistema II e le xantofille de-epossidate, l'antheraxanthin, la luteina e in particolare la zeaxantina13. qE rilassa il più veloce di qualsiasi componente NPQ (< 2 min)14, e l'attivazione reversibile del qE è quindi particolarmente importante per l'adattamento alle intensità della luce mutevoli. Una seconda fase più lenta del rilassamento NPQ (~2-30 min) comprende sia qT, correlata alle transizioni di stato, sia qZ, che coinvolge l'interconversione della zeaxantina in violaxantina15. Il rilassamento lento (> 30 min) di NPQ può includere sia la tempra fotoinibitoria (qI)16 che processi indipendenti dal fotodanno17,18, come il qH, che è una tempra sostenuta nelle antenne periferiche di PSII mediata da una proteina lipocalina plastide19,20.
NPQ aumenta durante l'esposizione alla luce intensa. Il successivo trasferimento in condizioni di scarsa illuminazione può comportare una downregulation di NPQ. Il decadimento delle fasi di rilassamento veloce, intermedio e lento può essere catturato nei parametri di una funzione biemi esponenziale 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
La base teorica per la funzione bi-esponenziale si basa sull'assunzione dell'utilizzo del primo ordine di ipotetici quecher, tra cui qE (Aq1), il rilassamento combinato di qZ e qT (Aq2), con le corrispondenti costanti temporali τq1 e τq2, e NPQ a lungo termine, che include qI e processi indipendenti dal fotodanno (Aq3). Come tale, la funzione bi-esponenziale fornisce una rappresentazione più realistica dei molteplici processi biologici connessi coinvolti nella tempra della clorofilla rispetto a una più semplice equazione di Hill che manca di una base teorica24.
NPQ può essere misurato utilizzando una varietà di fluorometri PAM disponibili in commercio 25,26, dai semplici dispositivi portatili27 ai sistemi chiusi più avanzati28. Tuttavia, una limitazione di molti di questi approcci è un throughput relativamente basso, che rende difficile lo screening di grandi collezioni di piante senza più dispositivi e un team di ricercatori. Per affrontare questo problema, McAusland et al. hanno sviluppato una procedura basata sul tessuto fogliare asportato e l'hanno utilizzata per identificare le differenze nella fluorescenza della clorofilla tra due cultivar di grano29. L'attrazione di questo approccio è che l'imaging dei dischi fogliari, prelevati da più piante con un singolo dispositivo, può facilitare lo screening di centinaia di genotipi in un giorno. Ciò consente di valutare la variazione nel rilassamento NPQ come parte di studi di associazione a livello di genoma o per lo screening di popolazioni riproduttive con il potenziale per aumentare l'efficienza fotosintetica delle colture e, in definitiva, la resa.
Basandoci sui risultati di McAusland et al.29, utilizziamo l'analisi di fluorescenza della clorofilla PAM dei dischi fogliari per lo screening ad alto rendimento dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (G.max; soia). Questo protocollo utilizza il CF Imager25, che è paragonabile ad altri sistemi PAM chiusi disponibili in commercio, come il popolare FluorCam26. Con una stanza buia per l'adattamento dei campioni, gli utenti possono visualizzare piatti a 96 pozzetti, piastre di Petri e piccole piante. Il vantaggio principale di questo approccio è l'aumento della produttività offerto dall'utilizzo di dischi fogliari rispetto all'analisi sequenziale dei singoli impianti. Qui presentiamo risultati rappresentativi e un metodo per il campionamento, la misurazione e l'analisi di NPQ in piante coltivate sul campo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

La fotosintesi non è ottimizzata nelle moderne varietà di colture e quindi offre un'opportunità di miglioramento. Accelerare il rilassamento della tempra non fotochimica (NPQ) si è dimostrata una strategia efficace per aumentare le prestazioni fotosintetiche. Tuttavia, il potenziale di riproduzione per migliorare NPQ e una comprensione completa delle basi genetiche del rilassamento NPQ è carente a causa delle limitazioni del sovracampionamento e della raccolta di dati da piante coltivate in campo. Sulla base di rapporti precedenti, presentiamo un test ad alto rendimento per l'analisi dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (soia) utilizzando la fluorometria clorofilliana modulata dall'ampiezza dell'impulso (PAM). I dischi fogliari vengono campionati da semi di soia coltivati in campo prima del trasporto in un laboratorio dove il rilassamento NPQ viene misurato in un fluorometro PAM chiuso. I parametri di rilassamento NPQ sono calcolati adattando una funzione bie-esponenziale ai valori NPQ misurati a seguito di una transizione da alta a bassa illuminazione. Utilizzando questo metodo, è possibile testare centinaia di genotipi in un giorno. La procedura ha il potenziale per schermare i pannelli mutanti e di diversità per la variazione nel rilassamento NPQ e può quindi essere applicata a domande di ricerca sia fondamentali che applicate.

La Figura 1A illustra una misura tipica di NPQ nella soia coltivata in campo. Le piante sono state coltivate a Urbana, IL (latitudine 40.084604°, longitudine -88.227952°) durante l'estate 2021, con semi piantati il 5 giugno. 2021. I dischi fogliari sono stati campionati dopo 30 giorni di semina e le misurazioni sono state effettuate con il protocollo fornito (Tabella 1). I valori Fv/Fm e NPQ sono stati calcolati per ciascun disco fogliare (Tabella...

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High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Il protocollo introduce un metodo ad alto rendimento per misurare il rilassamento della tempra non fotochimica mediante fluorometria clorofilliana modulata in ampiezza di impulso. Il metodo viene applicato alla glicina max coltivata sul campo e può essere adattato ad altre specie per lo screening della diversità genetica o delle popolazioni riproduttive.

Analisi ad alto rendimento della tempra non fotochimica nelle colture utilizzando la fluorometria clorofilla modulata con ampiezza di impulso

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Questo metodo può fornire una visione della variazione genetica nella tempra non fotochimica disponibile all'interno di pannelli di diversità genetica o popolazioni riproduttive. Il vantaggio principale di questa tecnica è il potenziale per lo screening di un gran numero di genotipi per la variazione della tempra non fotochimica entro un solo giorno. Il protocollo è presentato per la glicina max o la soia, ma può essere adattato per analizzare altri spazi vegetali da cui possono essere raccolti i dischi di sollevamento.Per qualcuno che esegue il protocollo per la prima volta, la chiave è maneggiare il disco di sollevamento per evitare danni o spugne troppo saturanti con acqua. Per iniziare, campionare le piante nel sito del campo 30 giorni dopo la germinazione. Riempire 1/3 di livello di acqua distillata in tutti i pozzi di un piatto a 24 pozzetti.Etichettare il coperchio e il lato della piastra con le repliche da campionare. Tenere la foglia più giovane completamente espansa presente nella parte superiore della pianta contro un tappo di gomma. Premere una piralide di sughero Humboldt numero due attraverso la foglia e ruotare per tagliare un disco, evitando la costola centrale.Raccogli consecutivamente cinque dischi dalla stessa foglia per le repliche tecniche. Spingere i dischi fogliari fuori dalla piralide del sughero in un unico pozzetto di un piatto a 24 pozzetti usando un batuffolo di cotone e ripetere questo per una pianta diversa dello stesso genotipo. Controllare che tutti i dischi fogliari galleggino nell'acqua.In caso contrario, spostare delicatamente i dischi fogliari che si attaccano al lato di un pozzo in posizione fluttuante con un batuffolo di cotone. Passare al campionamento dei dischi dal seguente grafico. Posizionare il coperchio e sigillare con un film flessibile semitrasparente.dopo aver completato il campionamento nell'intera piastra a 24 pozzetti. Conservare la piastra lontano dalla luce solare diretta in un sacchetto, una scatola o un dispositivo di raffreddamento vuoto. In uno spazio di laboratorio pulito, toccare il coperchio della piastra sigillata per rimuovere i dischi fogliari attaccati al coperchio durante il trasporto.Scartare il film e rimuovere il coperchio. Trasferire un disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti in una piastra fresca a 96 pozzetti con il disco fogliare rivolto verso il basso nella parte inferiore del pozzetto. Tagliare a metà un filtro aspiratore nasale.Immergere il filtro risultante a metà dell'acqua e tamponare su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Inserire il filtro nel pozzetto con il disco fogliare per mantenere l'umidità. Prendere un secondo disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti e posizionarlo a faccia in giù nella successiva posizione disponibile della piastra a 96 pozzetti.Immergere la restante metà del filtro nasale prodotto in acqua e tamponarlo su un tovagliolo di carta prima di inserirlo nel pozzo con il secondo disco fogliare. Nastro nell'angolo in alto a destra per orientare la lastra al buio per l'imaging. Sigillare le piastre con un film flessibile semitrasparente e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio.Scrivi gli ID del plottaggio e l'ID della piastra sul foglio di alluminio. Posizionare le piastre in una scatola o in un armadio scuro per un minimo di 30 minuti per il rilassamento delle prime due fasi di tempra non fotochimica. Utilizzare un periodo di incubazione scuro prolungato di un'ora prima dell'imaging se sono interessanti fasi a lungo termine di tempra non fotochimica.Preparare una piastra fittizia aggiuntiva per la messa a fuoco durante l'analisi posizionando un disco fogliare in ogni angolo di una piastra fresca a 96 pozzetti e uno al centro. Fissare i dischi fogliari con filtri nasali come fatto con le piastre precedenti, sigillare la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente e al 50% di umidità relativa. Accendere l'imager e aprire il software di imaging.Fare clic su Impostazioni seguite da Protocollo per aprire una finestra per l'inserimento dei passaggi nel protocollo sperimentale PAM. Impostare le specifiche tecniche della macchina fornite nel manoscritto. Impostare il programma per iniziare con un impulso di saturazione per misurare la massima efficienza quantistica della fotosintesi adattata al buio inserendo 20 secondi nella casella denominata After a delay of.Fare clic sulla casella Applica impulso e immettere 1 nella casella intitolata Questo numero di volte. Impostare l'impulso PPFD su 6.152, la lunghezza dell'impulso su 800 millisecondi e selezionare la casella Prendi immagini prime F e FM prime con tutti gli impulsi. Selezionare Inserisci dopo per aggiungere un secondo passaggio al protocollo.Immettere 30 secondi nella casella intitolata Dopo un ritardo di. Quindi, selezionare l'opzione Cambia attinico e immettere 50 nella casella denominata PPFD attinico per impostare l'intensità della luce nella camera su 50 PPFD. Fare clic su Inserisci dopo per aggiungere un nuovo passaggio al protocollo e immettere 150 secondi nella casella intitolata Dopo un ritardo di.Selezionare Applica impulso e immettere 4 nella casella intitolata Questo numero di volte per applicare impulsi di misurazione ogni 150 secondi quattro volte di seguito mentre la luce attinica è mantenuta a 50 PPFD. Regolare il ritardo e l'intensità della luce per ogni passaggio in base ai valori forniti nel manoscritto prima di salvare il protocollo come file pcl nella posizione desiderata. Spegnere la luce e posizionare la piastra fittizia a faccia in giù sullo stadio del campione in modo che la superficie assiale della foglia punti verso l'alto verso il rilevatore e che la spugna sia rivolta verso il basso verso la piattaforma.Impostare l'altezza dello stadio del campione in modo che i dischi fogliari siano 140 millimetri sopra la base dello strumento. Fare clic sull'icona Connetti/disconnetti alla fotocamera imager e alla fotocamera hardware per avviare la fotocamera. Fare clic sul simbolo di fluorescenza di messa a fuoco, rappresentato da un'icona a forma di freccia a due lati di colore rosso con due linee verdi alla base, e regolare l'obiettivo e l'esposizione per mettere a fuoco la piastra.Fare di nuovo clic sull'icona di messa a fuoco della fluorescenza per spegnere la luce lampeggiante. Lavorando al buio, sostituire la piastra fittizia con la piastra da analizzare. Posizionalo a faccia in giù con il nastro all'esterno utilizzato per orientare l'angolo in alto a destra e fai clic sull'icona della fotocamera dell'immagine della mappa.Regola l'esposizione dell'immagine aprendo o chiudendo l'apertura fino a quando la barra nella finestra popup non è posizionata nella zona verde. Fare clic sul pulsante Riprova dopo ogni regolazione dell'apertura fino a quando l'esposizione non viene regolata correttamente e lo strumento acquisisce un'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Applica isolamento immagine per bloccare i segnali di sfondo.L'area foglia focalizzata verrà visualizzata in grigio e lo sfondo in blu. Selezionare l'area o i pixel di interesse per includere solo i dischi foglia regolando l'istogramma e il livello di gamma dal menu a discesa Modifica immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina tagli alti e bassi per eliminare le aree evidenziate in azzurro.Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina randagi per rimuovere eventuali pixel che non toccano gli ultimi tre pixel. Tutte le aree dell'immagine che appaiono come isole isolate verranno analizzate separatamente e incluse nell'output finale dei dati. Fare clic sull'icona Esegui protocollo per avviare il programma.Un timer apparirà nella parte inferiore dello schermo che ti informerà quanto tempo è rimasto il protocollo da eseguire. Attendere il completamento del protocollo. Fare clic su File e Salva con nome per salvare i dati come file igr.Chiudi la finestra facendo clic sulla croce rossa in alto a destra della finestra prima di avviare un'altra piastra campione. Per esportare i dati di fluorescenza della clorofilla, apri il file igr nel software di imaging e fai clic su File seguito da Esporta nella cartella per creare una nuova cartella con tutti i file necessari. Una tipica misurazione della tempra non fotochimica nei semi di soia coltivati in campo ha mostrato che dopo un flash di saturazione iniziale per determinare Fv / Fm quando i dischi fogliari erano esposti a scarsa illuminazione di 50 micromoli al metro al secondo, la tempra non fotochimica era inferiore a uno.Inoltre, al momento del trasferimento in condizioni di luce elevata di 2.000 micromoli al metro al secondo, la tempra non fotochimica è aumentata fino al valore massimo di quattro dopo 15 minuti. Una misurazione fallita ha mostrato un aumento minimo della tempra non fotochimica al momento del trasferimento in condizioni di luce elevata. L'orientamento delle piastre all'interno dell'imager e un piano chiaramente definito per il campionamento e la placcatura dei dischi fogliari sono essenziali per garantire che i dati siano collegati al genotipo corretto.Questo protocollo può quantificare l'impatto di variabili ambientali come la siccità e lo spargimento sulla tempra non fotochimica o valutare la tempra non fotochimica a diversi livelli di chioma per perfezionare i modelli di coltura.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Ricerca

Biologia

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

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Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

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Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

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Autore in primo piano: Avanzamento dell'editing genetico nelle foglie di bambù per alternative sostenibili alla plastica 

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