Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

この研究は、Bill & Melinda Gates Foundation、Foundation for Food and Agriculture Research、および英国外国、連邦および開発局が助成金番号OPP1172157で資金提供している研究プロジェクトRealize Increasing Photosynthetic Efficiency(RIPE)によって支援されています。

1. 種を植える
<ol><li>肥沃で水はけがよく、砂質の土壌ではなく、pHがほぼ6.5の畑のサイトを選択してください。1.2 mの列のプロットを0.75 mの間隔でマークし、鍬で地面を得点します。</li>
	<li>土壌温度が25〜30°Cの間である成長期の初めに、各プロットに沿って3cmの深さで G.max cv. IA3023の50種子/ mを植える。 注:遺伝的多様性をスクリーニングする目的で、複数の異なる遺?...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

リーフディスクの慎重な選択と取り扱いは、NPQの信頼性の高い測定値を得るために重要です。第一に、ピンセットによる粗い取り扱いなどの組織への損傷は、ストレスをもたらし、光合成の最大量子効率のための低い値をもたらす。非ストレス植物は、典型的には、約0.8318のFv/Fm値を有し、有意な低下は光合成性能の低下を示す9</s...

光合成は、光吸収、一次電子移動、エネルギー安定化、光合成産物の合成と輸送からなる1.各ステップを理解することは、作物の光合成効率を高めるための努力を導くために不可欠です。光は光合成の速度に影響し、光子の形でのエネルギー供給と等価物を減らすための需要のバランスをとる必要があります。供給が需要を超える場合、例えば、高光下または気孔閉鎖によって引き起こされるCO2 固定の減少中に、還元力の蓄積は、光合成装置を損傷し、電子輸送を損なう可能性のある活性酸素種形成の可能性を高める。したがって、損傷を防ぐために、植物は活性酸素種の無害化および励起クロロフィル状態(NPQ)2の非光化学的消光を含むいくつかの光保護機構を開発した。
光合成を高い速度で維持することは、フィールド環境下では困難です。季節的および日周的な変化は、風による葉の動きや一時的な雲量などの環境変動とともに、植物が光合成のために受け取る光の量と強度に変化を引き起こします3。NPQは余分な光エネルギーを放散し、ハイライト4での光合成の持続速度を可能にしながら、光損傷を防ぐのに役立ちます。しかし、高光から低照度の遷移中にNPQが長引くと、炭素削減に使用できるエネルギーが散逸し続けます5。その結果、NPQの緩和を高速化することで、光合成6の効率を高めることができ、NPQ緩和は作物改良のための魅力的なターゲットとなる。
パルス振幅変調クロロフィル蛍光(PAM)分析は、測定可能なパラメータ(補足表1および補足表 2)7、8、9からNPQを計算するために使用することができる。本稿では、生殖質の自然変動をスクリーニングする目的で、野外植物におけるNPQ緩和率の決定に焦点を当てる。しかしながら、PAMクロロフィル蛍光測定分析は、藻類から高等植物に至るまでの種に適用され、多種多様な目的にも使用することができ、他の場所でレビューされている7、8、9。
暗く適応した葉や細胞では、光系II(PSII)反応中心は電子を受け取るために開いており、NPQはありません。低強度の測定光をオンにすると、PSIIを介した電子輸送を回避しながらクロロフィル蛍光を誘発します。この暗適応状態で記録された最小蛍光は、パラメータFoによって記述される。暗に適応した葉に高強度の光パルスを印加すると、キノンA部位に結合したキノンの第一の安定電子受容体プールを急速に減少させることができる。これは、PSII反応中心における電子移動能力を一時的に遮断し、PSII反応中心は閉鎖的であり、水分解から電子を受け取ることができないと言われる。短いパルス持続時間を使用することにより、NPQを刺激するのに十分な時間がない。得られたクロロフィル蛍光は、NPQの非存在下で得られる最大値、または最大蛍光、Hmに相当する。最小蛍光と最大蛍光の差は、可変蛍光Fvと呼ばれます。光系IIの最大光化学量子収率(Fv/Fm)は、次の式を使用してこれら2つのパラメータから計算されます。
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
これは、光系の機能とストレスの重要な指標を提供することができます。活性(光合成)光をオンにすると、非光化学的消光が刺激され、その後の飽和フラッシュの適用により、光に適応した最大蛍光Fm'の測定が可能になります。暗と光に適合した最大蛍光の差を比較することにより、NPQはスターン・ボルマー式10に従って計算できます。
NPQ = F m/Fm' - 1
高等植物では、NPQはqE、qT、qZ、qIおよびqHを含む少なくとも5つの異なる成分からなると記載されている。NPQに関わる正確なメカニズムは完全には理解されていません。しかし、qEはほとんどの植物においてNPQの主要な構成要素であると考えられている。qEの完全な関与のための重要な要因には、チラコイド膜を横切る陽子勾配の蓄積、光系IIサブユニットS11,12の活性、および脱エポキシ化キサントフィル、アンテラキサンチン、ルテイン、および特にゼアキサンチン13が含まれることが見出されている。qEはNPQ成分の中で最も速く(<2分)14を緩和し、したがってqEの可逆的活性化は光強度のシフトへの適応にとって特に重要である。NPQ緩和の第2のより遅い段階(〜2〜30分)は、状態遷移に関連するqTと、ゼアキサンチンからビオラキサンチン15への相互変換を伴うqZの両方を包含する。NPQの緩慢弛緩(>30分)は、プラスチドリポカリンタンパク質19,20によって媒介されるPSIIの末梢アンテナにおける持続的な消光であるqHなどの光損傷17,18とは無関係の光阻害性消光(qI)16およびプロセスの両方を含み得る。
NPQは、高光に曝されると増加します。その後の低照度への転送は、NPQのダウンレギュレーションにつながる可能性があります。高速、中間、および低速の緩和位相の減衰は、双指数関数15,21,22,23のパラメータに取り込むことができます。
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
双指数関数の理論的基礎は、qE(Aq1)、qZとqTの結合緩和(Aq2)、対応する時定数τq1とτq2、およびqIと光損傷に依存しないプロセス(Aq3)を含む長期NPQを含む仮説的なクエンチャーの一次利用の仮定に基づいています。このように、双指数関数は、理論的根拠を欠いているより単純なヒル方程式と比較して、クロロフィル蛍光の消光に関与する複数の接続された生物学的プロセスのより現実的な表現を提供する24。
NPQは、単純なハンドヘルド装置27からより高度なクローズドシステム28まで、様々な市販のPAM蛍光光度計25、26を用いて測定することができる。しかし、これらのアプローチのいくつかの制限は、比較的低いスループットであり、複数のデバイスと研究者のチームなしで植物の大規模なコレクションをスクリーニングすることは困難です。この問題に対処するために、McAuslandらは、摘出した葉組織に基づく手順を開発し、それを使用して、2つの小麦品種間のクロロフィル蛍光の違いを同定した29。このアプローチの魅力は、単一の装置で複数の植物から採取されたイメージングリーフディスクが、1日以内に何百もの遺伝子型のスクリーニングを容易にすることができることです。これにより、ゲノムワイド関連研究の一環としてNPQ緩和の変動を評価したり、作物の光合成効率を高め、最終的に収量を増加させる可能性のある育種集団をスクリーニングしたりすることができます。
McAusland et al.29の知見に基づいて、我々はグリシンマックス(G.max;ダイズ)におけるNPQ緩和率のハイスループットスクリーニングのために、葉ディスクのPAMクロロフィル蛍光分析を使用する。このプロトコルは、一般的なFluorCam26などの他の市販のクローズドPAMシステムに匹敵するCFイメージャ25を使用します。サンプルを適応させるための暗い部屋で、ユーザーは96ウェルプレート、ペトリ皿、小さな植物を画像化できます。このアプローチの主な利点は、個々のプラントのシーケンシャル分析と比較して、リーフディスクを使用することによって得られるスループットの増加です。本明細書では、代表的な結果、および野外栽培植物におけるNPQのサンプリング、測定、および分析のための方法を提示する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

光合成は現代の作物品種では最適化されていないため、改善の機会を提供します。非光化学消光(NPQ)の緩和をスピードアップすることは、光合成性能を向上させるための効果的な戦略であることが証明されています。しかし、NPQの改善とNPQ緩和の遺伝的基盤の完全な理解のために繁殖する可能性は、野外で栽培された作物植物からのオーバーサンプリングとデータ収集の制限のために欠けている。以前の報告に基づいて、我々は、パルス振幅変調(PAM)クロロフィル蛍光測定法を用いて グリシンマックス (大豆)におけるNPQ緩和率を分析するためのハイスループットアッセイを提示する。葉のディスクは、NPQ緩和が閉じたPAM蛍光光度計で測定される実験室に輸送される前に、畑で栽培された大豆からサンプリングされます。NPQ緩和パラメータは、高輝度から低照度への移行後に測定されたNPQ値に双指数関数を当てはめることによって計算されます。この方法を使用すると、1日以内に何百もの遺伝子型を検査することができます。この手順は、NPQ緩和の変動について変異体および多様性パネルをスクリーニングする可能性を秘めているため、基礎研究と応用研究の両方の質問に適用することができます。

図1Aは、畑で栽培された大豆におけるNPQの典型的な測定値を示しています。2021年夏にイリノイ州アーバナ(緯度40.084604°、経度-88.227952°)で植物を栽培し、6月5日に種子を植えました。種子を植え付けてから30日後にリーフディスクをサンプリングし、提供されたプロトコルで測定を行った(表1)。Fv/FmおよびNPQ値は各リーフディスクについて計算さ?...

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High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス に適用され、遺伝的多様性または繁殖集団をスクリーニングするために他の種に適応させることができる。

パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定を用いた作物の非光化学的急冷のハイスループット分析

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

この方法は、遺伝的多様性パネルまたは育種集団内で利用可能な非光化学的消光における遺伝的変異についての洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、1日以内に非光化学的消光の変動について多数の遺伝子型をスクリーニングする可能性である。このプロトコルは、グリシンマックスまたは大豆について提示されていますが、リフトディスクを収集できる他の植物空間を分析するために適合させることができます。初めてプロトコルを実行する人にとって、鍵となるのは、損傷や水によるスポンジの過飽和を防ぐためにリフトディスクを処理することです。開始するために、発芽後30日目に畑のサイトで植物をサンプリングする。24ウェルプレートのすべてのウェルに1/3レベルの蒸留水を充填します。蓋とプレートの側面に、サンプリングする反復物のラベルを付けます。植物の上部にある最年少の全膨張葉をゴム栓に当てます。数2のフンボルトコルクボーラーを葉を通して押し、中肋骨を避けてディスクを切るためにねじります。技術的な複製のために、同じ葉から5枚のディスクを連続して収集します。綿棒を使用して、コルクボーラーから葉のディスクを24ウェルプレートの単一のウェルに押し出し、同じ遺伝子型の別の植物に対してこれを繰り返します。すべてのリーフディスクが水に浮かんでいることを確認します。そうでない場合は、井戸の側面にくっついている葉のディスクを綿棒で浮かせた位置に静かに動かします。次のプロットからサンプリングディスクに進みます。蓋をし、半透明の可撓性フィルムでシールします。サンプリングを完了した後、24ウェルプレート全体。プレートを直射日光の当たらない場所で袋、箱、または空のクーラーに保管してください。清潔な実験室スペースで、密封プレートの蓋をタップして、輸送中に蓋に貼り付けられたリーフディスクを外します。フィルムをほどき、蓋を外します。リーフディスクを24ウェルプレートの最初の位置から、リーフディスクがウェルの底で平らに下を向いた状態で新鮮な96ウェルプレートに移します。鼻吸引フィルターを半分に切る。得られたフィルターを半分水に浸し、ペーパータオルを軽くたたいて余分な液体を取り除きます。湿度を維持するために、リーフディスクでフィルターを井戸に挿入します。24ウェルプレートの最初の位置から2番目のリーフディスクを取り出し、96ウェルプレートの次に利用可能な位置に下向きに置きます。生成された鼻フィルターの残りの半分を水に浸し、ペーパータオルに軽くたたいてから、2枚目のリーフディスクで井戸に挿入します。右上隅をテープで留めて、暗闇の中でプレートの向きを合わせてイメージングできるようにします。半透明の可撓性フィルムでプレートをシールし、アルミニウム箔で包みます。アルミ箔にプロットIDとプレートIDを書き込みます。非光化学的消光の最初の2つの段階を緩和するために、プレートを暗い箱またはキャビネットに最低30分間置きます。非光化学的消光の長期相が興味深い場合は、イメージングの前に1時間の長期暗インキュベーション期間を使用してください。新しい96ウェルプレートの各隅にリーフディスクを置き、中央に1枚ずつ配置して、分析中に焦点を合わせるための追加のダミープレートを準備します。以前のプレートと同様に、葉のディスクを鼻フィルターで固定し、プレートを密封し、室温および相対湿度50%の暗所でインキュベートします。イメージャーの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。[設定]をクリックしてから[プロトコル]をクリックして、PAM実験プロトコルのステップを入力するためのウィンドウを開きます。原稿で提供されている機械の技術仕様を設定します。飽和パルスで開始するようにプログラムを設定し、After という遅延のボックスに 20 秒を入力して暗に適応した光合成の最大量子効率を測定します。「パルスを適用」ボックスをクリックし、「この回数」というタイトルのボックスに「1」と入力します。パルスPPFDを6、152、パルス長を800ミリ秒に設定し、すべてのパルスでFプライムとFMプライム画像を取るボックスにチェックを入れます。[後に挿入] をオンにして、プロトコルに 2 番目のステップを追加します。「遅延の後」というタイトルのボックスに「30 秒」と入力します。次に、[アクチニックの変更] オプションを選択し、[アクチニック PPFD] というタイトルのボックスに「50」と入力して、チャンバーの光強度を 50 PPFD に設定します。[後に挿入] をクリックしてプロトコルに新しいステップを追加し、[遅延の後] というタイトルのボックスに「150 秒」と入力します。[パルスの適用] を選択し、[この回数] というタイトルのボックスに「4」と入力して、活性光が 50 PPFD に保持されている間に 150 秒ごとに測定パルスを 4 回連続して印加します。原稿に示されている値に従って各ステップの遅延と光強度を調整してから、プロトコルをPCLファイルとして目的の場所に保存します。ライトをオフにし、ダミープレートをサンプルステージに裏返して、葉のアキシャル面が検出器に向かって上向きになり、スポンジがプラットフォームに向かって下を向くようにします。サンプルステージの高さは、リーフディスクが機器のベースから140ミリメートル上になるように設定します。イメージャーカメラとハードウェアカメラへの接続/切断アイコンをクリックして、カメラを起動します。ベースに緑色の 2 本の線が付いた赤色の両面矢印アイコンで表されるフォーカス蛍光シンボルをクリックし、レンズと露出を調整してプレートに焦点を合わせます。フォーカス蛍光アイコンをもう一度クリックして、点滅するライトをオフにします。暗闇の中で作業する場合は、ダミー プレートを分析対象のプレートと交換します。右上隅の向きに使用したテープを外側にして裏返しに置き、地図画像カメラアイコンをクリックします。ポップアップウィンドウのバーがグリーンゾーンに配置されるまで絞りを開閉して、画像の露出を調整します。絞りを調整するたびに、露出が正しく調整され、機器が画像を撮影するまで、再試行ボタンをクリックします。画像を右クリックし、[画像分離の適用]を選択して背景信号をブロックします。フォーカスされたリーフ領域は灰色で、背景は青で表示されます。画像を右クリックして、[画像の変更]プルダウンメニューからヒストグラムとガンマレベルを調整して、リーフディスクのみを含める領域またはピクセルを選択します。画像を右クリックし、[ハイカットとローカットを削除]を選択して、水色で強調表示された領域を削除します。画像を右クリックし、[ストレイの削除]を選択して、最後の3つの他のピクセルに触れていないピクセルを削除します。孤立した島として表示される画像上の領域は、個別に分析され、最終的なデータ出力に含まれます。プロトコルの実行アイコンをクリックして、プログラムを起動します。タイマーが画面の下部に表示され、プロトコルの実行時間が経過したことを通知します。プロトコルが終了するまで待ちます。[ファイルと名前を付けて保存] をクリックして、データを igr ファイルとして保存します。ウィンドウの右上にある赤い十字をクリックしてウィンドウを閉じてから、別のサンプルプレートを開始します。クロロフィル蛍光データをエクスポートするには、イメージングソフトウェアでigrファイルを開き、[ファイル]をクリックしてから[フォルダにエクスポート]をクリックして、必要なすべてのファイルを含む新しいフォルダを作成します。畑で栽培された大豆における非光化学的消光の典型的な測定は、葉のディスクが毎秒1メートルあたり50マイクロモルの低光にさらされたときにFv/Fmを決定するための最初の飽和フラッシュの後、非光化学的消光は1未満であったことを示した。さらに、毎秒1メートルあたり2,000マイクロモルの高光に移すと、非光化学的消光は15分後に最大値の4まで増加した。失敗した測定は、高光への転送時の非光化学的消光の最小の増加を示した。イメージャー内のプレートの向きと、リーフディスクのサンプリングとメッキの明確に定義された計画は、データが正しい遺伝子型にリンクされていることを確認するために不可欠です。このプロトコルは、干ばつや脱落などの環境変数が非光化学的消光に及ぼす影響を定量化したり、異なるキャノピーレベルで非光化学的急冷を評価して作物モデルを改良することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

生物学

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

ゼブラフィッシュ稚魚を用いた消化管通過時間の高スループット測定

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

手動受粉、顕微鏡検査、および S遺伝子型分析を使用した柑橘類の自己(非)適合性および相互(非)適合性関係の決定

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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竹の遺伝子形質転換・編集法の開発

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

著者スポットライト:持続可能なプラスチック代替品のための竹の葉の遺伝子編集の進歩 

都市: Planta(プランタ) 孝宗竹葉の遺伝子発現と遺伝子編集

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...