Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

이 연구는 Bill & Melinda Gates Foundation, Food and Agriculture Research 재단 및 영국 외국, 연방 및 개발 사무소가 보조금 번호 OPP1172157로 자금을 지원하는 연구 프로젝트 RIPE (Realize Increase Photosynthetic Efficiency)에 의해 지원됩니다.

1. 종자 심기
<ol><li>비옥하고 배수가 잘되지만 모래 토양이 아니며 pH가 거의 6.5 인 밭을 선택하십시오. 괭이로 땅을 득점하여 0.75m 간격의 1.2m 행 플롯을 표시하십시오.</li>
	<li>토양 온도가 25 ~ 30 ° C 사이인 성장기 초에 각 플롯을 따라 3cm 깊이에서 G.max cv. IA3023의 50 종자 / m를 심습니다. 참고 : 유전 적 다양성을 스크리닝하기 위해 여러 가지 다른 유전자형이 성장하고 비교 ?...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. 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Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. 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R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. 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P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

리프 디스크의 신중한 선택과 취급은 NPQ의 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위해 매우 중요합니다. 첫째, 핀셋으로 거친 취급과 같은 조직의 손상은 스트레스를 유발하여 광합성의 최대 양자 효율에 대한 낮은 값을 초래합니다. 비응력 플랜트는 일반적으로 약 0.8318의 F v/Fm 값을 가지며, 광합성 성능의 감소를 나타내는 상당한 감소를 나타냅니다<sup class=...

광합성은 광흡수, 일차 전자 전달, 에너지 안정화, 광합성 생성물의 합성 및 수송1로 구성된다. 각 단계를 이해하는 것은 작물 광합성 효율을 높이기위한 노력을 안내하는 데 중요합니다. 빛은 광합성 속도에 영향을 미치며, 광자의 형태로 에너지 공급의 균형을 맞추어야하며 등가물을 줄이기위한 수요가 필요합니다. 공급이 수요를 초과할 때, 예를 들어 고조도 하에서, 또는 구내성 폐쇄에 의해 야기된CO2 고정의 감소된 동안, 환원 전력의 축적은 광합성 장치를 손상시키고 전자 수송을 손상시킬 가능성이 있는 반응성 산소 종 형성의 확률을 증가시킨다. 따라서 손상을 방지하기 위해 식물은 반응성 산소 종의 해독 및 여기된 엽록소 상태 (NPQ)2의 비 광화학적 담금질을 포함한 몇 가지 광보호 메커니즘을 개발했습니다.
높은 광합성 속도를 유지하는 것은 현장 환경에서 어려운 일입니다. 계절 및 일주일 변화는 바람으로 인한 잎 움직임 및 일시적인 구름 덮개와 같은 환경 변동과 함께 광합성을 위해 식물이받는 빛의 양과 강도의 변화를 일으킵니다 3. NPQ는 과도한 광 에너지를 방출하고 고조도에서 지속적인 광합성 속도를 허용하면서 광손상을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다4. 그러나, 고조도 전이 동안 연장된 NPQ는 탄소 감소5에 사용될 수 있는 에너지를 계속 소산시킨다. 결과적으로 NPQ의 이완을 가속화하면 광합성6의 효율을 높일 수 있으므로 NPQ 완화는 작물 개선을위한 매력적인 대상이됩니다.
펄스 진폭 변조된 엽록소 형광(PAM) 분석은 측정 가능한 파라미터(보충 표 1 및 보충 표 2)7,8,9로부터 NPQ를 계산하는데 사용될 수 있다. 이 기사는 생식 형질의 자연 변이를 스크리닝하기 위해 현장 재배 식물에서 NPQ 이완률을 결정하는 데 중점을 둡니다. 그러나, PAM 엽록소 형광 분석 분석은 또한 조류에서 고등 식물에 이르는 종에 적용되는 매우 다양한 목적을 위해 사용될 수 있으며,다른 곳에서 검토된다 7,8,9.
어두운 적응 잎 또는 세포에서, 광계 II (PSII) 반응 센터는 전자를 받기 위해 개방되어 있으며 NPQ는 없다. 저강도 측정광을 켜면 엽록소 형광을 유도하면서 PSII를 통한 전자 수송을 피할 수 있습니다. 이러한 암적응 상태에서 기록된 최소 형광은 파라미터 Fo에 의해 설명된다. 어두운 적응 잎에 고강도 광 펄스를 적용하면 퀴논 A 부위에 결합된 퀴논의 첫 번째 안정한 전자 수용체 풀을 빠르게 감소시킬 수 있다. 이것은 일시적으로 PSII 반응 센터의 전자 전달 능력을 차단하며, PSII 반응 센터는 폐쇄되어 물 분해로 전자를 수신 할 수 없다고합니다. 짧은 펄스 지속 시간을 사용함으로써, NPQ를 자극할 시간이 불충분하다. 생성된 엽록소 형광은 NPQ 또는 최대 형광, Fm의 부재 하에 수득가능한 최대값과 동등하다. 최소 형광과 최대 형광의 차이는 가변 형광, Fv로 지칭된다. 광계 II (Fv /Fm)의 최대 광화학 양자 수율은 다음 방정식을 사용하여이 두 매개 변수에서 계산됩니다.
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
이것은 광계 기능과 스트레스의 중요한 지표를 제공 할 수 있습니다. actinic (광합성) 빛을 켜면 비 광화학 담금질이 자극되며, 포화 플래시의 후속 적용은 광에 적응 된 최대 형광 인 FM '의 측정을 가능하게합니다. 어두운 형광과 광적응된 최대 형광의 차이를 비교함으로써, NPQ는 스턴-볼머 방정식10에 따라 계산될 수 있다:
NPQ = F m / Fm ' - 1
고등 식물에서, NPQ는 qE, qT, qZ, qI 및 qH를 포함하는 적어도 다섯 개의 별개의 성분으로 구성된 것으로 기술되었다. NPQ와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 그러나 qE는 대부분의 플랜트에서 NPQ의 주요 구성 요소로 간주됩니다. qE의 완전한 참여를 위한 결정적인 인자는 틸라코이드 막을 가로지르는 양성자 구배의 축적, 광계 II 서브유닛 S11,12의 활성, 및 탈에폭시화된 크산토필, 안테락산틴, 루테인, 및 특히 제아잔틴13을 포함하는 것으로 밝혀졌다. qE는 모든 NPQ 성분 중 가장 빠른 속도를 완화시키며(< 2분)14, 따라서 qE의 가역적 활성화는 시프팅 광도에 대한 적응에 특히 중요하다. NPQ 완화의 두 번째 느린 단계 (~ 2-30 분)는 상태 전이와 관련된 qT와 제아잔틴을 비올라잔틴15로 상호 변환하는 qZ를 모두 포함합니다. NPQ의 느린 이완(> 30분)은 색소체 리포칼린 단백질(19,20)에 의해 매개되는 PSII의 말초 안테나에서 지속적인 담금질되는 qH와 같은 광손상 담금질(qI)16 및 광손상(17,18)과 무관하게 처리되는 과정 모두를 포함할 수 있다.
NPQ는 높은 빛에 노출되는 동안 증가합니다. 저조도로의 후속 전달은 NPQ의 하향 조절을 초래할 수 있습니다. 빠르고, 중간이며, 느린 이완 단계의 붕괴는 이중 지수 함수15,21,22,23의 파라미터에서 포착될 수 있다.
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
이중 지수 함수에 대한 이론적 근거는 qE (Aq1), qZ 및 qT (Aq2)의 결합 된 완화, 해당 시간 상수 τq1 및 τq2, qI 및 광손상 독립적 프로세스 (Aq3)를 포함하는 장기 NPQ를 포함한 가상의 담금질기의 1 차 활용 가정을 기반으로합니다. 이와 같이, 이지수 함수는 이론적 근거(24)가 결여된 더 단순한 힐 방정식에 비해 엽록소 형광을 담금질하는데 관여하는 다중 연결된 생물학적 과정의 보다 현실적인 표현을 제공한다.
NPQ는 간단한 핸드헬드 장치(27)로부터 보다 진보된 폐쇄 시스템(28)에 이르기까지 다양한 상업적으로 이용가능한 PAM 플루오로미터(25,26)를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나 이러한 접근법 중 몇 가지의 한계는 상대적으로 낮은 처리량으로 인해 여러 장치와 연구원 팀 없이는 대규모 식물 컬렉션을 선별하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 McAusland et al.은 절제된 잎 조직을 기반으로 한 절차를 개발하여 두 밀 품종29 사이의 엽록소 형광의 차이를 확인하는 데 사용했습니다. 이 접근법의 매력은 단일 장치로 여러 식물에서 가져온 잎 디스크를 이미징하면 하루 내에 수백 개의 유전자형을 쉽게 선별 할 수 있다는 것입니다. 이것은 게놈 광범위한 연관 연구의 일환으로 NPQ 이완의 변이를 평가하거나 작물 광합성 효율을 높이고 궁극적으로 수확 할 수있는 잠재력을 가진 번식 집단을 스크리닝하는 것을 가능하게합니다.
McAusland et al.29의 발견을 바탕으로, 우리는 글리신 맥스 (G.max; 대두)에서 NPQ 이완 속도의 높은 처리량 스크리닝을 위해 잎 디스크의 PAM 엽록소 형광 분석을 사용합니다. 이 프로토콜은 널리 사용되는 FluorCam26과 같은 상업적으로 이용 가능한 다른 폐쇄 PAM 시스템과 비교할 수있는 CF Imager25를 사용합니다. 샘플을 적응시킬 수 있는 어두운 공간을 통해 사용자는 96웰 플레이트, 페트리 접시 및 작은 식물을 이미지화할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 개별 식물의 순차적 분석과 비교하여 리프 디스크를 사용하여 제공되는 처리량이 증가한다는 것입니다. 본원에서 우리는 대표적인 결과, 및 현장 재배 식물에서 NPQ의 샘플링, 측정 및 분석을 위한 방법을 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

광합성은 현대 작물 품종에 최적화되어 있지 않으므로 개선의 기회를 제공합니다. 비 광화학 담금질 (NPQ)의 완화를 가속화하는 것은 광합성 성능을 향상시키는 효과적인 전략으로 입증되었습니다. 그러나, NPQ 개선을 위한 번식 가능성 및 NPQ 완화의 유전적 기초에 대한 완전한 이해는 현장 재배 작물 식물로부터의 오버샘플링 및 데이터 수집의 한계로 인해 부족하다. 이전 보고서를 기반으로 펄스 진폭 변조 (PAM) 엽록소 형광 측정법을 사용하여 글리신 맥스 (대두)에서 NPQ 이완 속도를 분석하기위한 고처리량 분석을 제시합니다. 잎 디스크는 실험실로 운반하기 전에 현장에서 재배 한 콩에서 샘플링되어 NPQ 이완이 폐쇄 된 PAM 형광계에서 측정됩니다. NPQ 이완 파라미터는 고조도에서 저조도로의 전환 후 측정된 NPQ 값에 이중 지수 함수를 피팅하여 계산됩니다. 이 방법을 사용하면 하루 안에 수백 개의 유전자형을 테스트 할 수 있습니다. 이 절차는 NPQ 완화의 변이에 대한 돌연변이 및 다양성 패널을 선별 할 수있는 잠재력을 가지고 있으므로 기본 및 응용 연구 질문 모두에 적용될 수 있습니다.

도 1A는 현장 성장 대두에서 NPQ의 전형적인 측정을 묘사한다. 식물은 2021 년 여름 동안 일리노이 주 우르바나 (위도 40.084604 °, 경도 -88.227952 °)에서 재배되었으며 씨앗은 6 월 5 일에 심어졌습니다. 2021. 잎 디스크는 종자를 심은 지 30 일 후에 샘플링되었고, 제공된 프로토콜로 측정이 이루어졌다(표 1). Fv/Fm 및 NPQ 값은 각 리프 디스크에 대해 계산되었?...

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High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

이 프로토콜은 펄스 진폭 변조된 엽록소 형광 측정법에 의한 비광화학적 담금질의 완화를 측정하기 위한 고처리량 방법을 도입한다. 이 방법은 현장에서 자란 글리신 맥스 에 적용되며 유전 적 다양성 또는 번식 집단을 스크리닝하기 위해 다른 종에 적응할 수 있습니다.

펄스 진폭 변조된 엽록소 형광계를 이용한 작물에서의 비광화학적 담금질의 고처리량 분석

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

이 방법은 유전 다양성 패널 또는 번식 집단 내에서 이용 가능한 비 광화학적 담금질의 유전 적 변이에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 하루 내에 비 광화학적 담금질의 변화에 대해 많은 수의 유전자형을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 글리신 맥스 또는 콩에 대해 제시되지만 리프트 디스크를 수집 할 수있는 다른 식물 공간을 분석하도록 조정할 수 있습니다.처음으로 프로토콜을 수행하는 사람의 경우, 열쇠는 물로 인한 손상이나 과포화 스폰지를 방지하기 위해 리프트 디스크를 처리하는 것입니다. 시작하려면 발아 후 30 일 후에 현장 사이트에서 식물을 샘플링하십시오. 24웰 플레이트의 모든 웰에 1/3 레벨의 증류수를 채웁니다.뚜껑과 플레이트의 측면에 샘플링할 반복실험으로 라벨을 붙입니다. 식물 꼭대기에있는 가장 어린 완전히 확장 된 잎을 고무 마개에 대고 잡으십시오. 두 번 훔볼트 코르크 보어를 잎을 통해 누르고 비틀어 디스크를 자르고 중간 갈비뼈를 피하십시오.기술 반복실험을 위해 동일한 리프에서 다섯 개의 디스크를 연속적으로 수집합니다. 코크 보어에서 잎 디스크를 면봉을 사용하여 24 웰 플레이트의 단일 웰로 밀어 넣고 동일한 유전자형의 다른 식물에 대해이를 반복하십시오. 모든 리프 디스크가 물에 떠 있는지 확인하십시오.그렇지 않은 경우 우물 측면에 달라 붙은 잎 디스크를 면봉으로 떠있는 위치로 부드럽게 옮깁니다. 다음 그림에서 샘플링 디스크로 이동합니다. 뚜껑을 놓고 반투명 플렉시블 필름으로 밀봉하십시오.전체 24-웰 플레이트에서 샘플링을 완료한 후. 접시를 직사광선으로부터 가방, 상자 또는 빈 냉각기에 보관하십시오. 깨끗한 실험실 공간에서 밀봉 된 플레이트의 뚜껑을 탭하여 운송 중에 뚜껑에 붙어있는 잎 디스크를 제거하십시오.필름 포장을 풀고 뚜껑을 분리합니다. 잎 디스크를 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 잎 디스크가 웰 바닥에서 평평하게 아래로 향하게 하여 신선한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 비강 흡입기 필터를 반으로 자릅니다.생성 된 필터를 물에 반쯤 담그고 종이 타월에 담그면 과도한 액체를 제거하십시오. 습도를 유지하기 위해 리프 디스크가있는 우물에 필터를 삽입하십시오. 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 두 번째 리프 디스크를 가져와 96웰 플레이트의 다음 사용 가능한 위치에 아래로 향하게 놓습니다.생성 된 비강 필터의 나머지 절반을 물에 담그고 종이 타월에 담그고 두 번째 잎 디스크로 우물에 삽입하십시오. 오른쪽 위 모서리에 테이프를 붙여서 어두운 곳에서 플레이트를 배치하여 이미징을 할 수 있도록 합니다. 플레이트를 반투명 플렉시블 필름으로 밀봉하고 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다.플롯 ID와 플레이트 ID를 알루미늄 호일에 씁니다. 비광화학적 담금질의 처음 두 단계의 이완을 위해 최소 30분 동안 어두운 상자 또는 캐비닛에 플레이트를 놓으십시오. 비광화학적 담금질의 장기 단계가 관심이있는 경우 이미징 전에 한 시간의 장기간의 어두운 잠복기를 사용하십시오.신선한 96웰 플레이트의 각 모서리에 잎 디스크를 배치하고 중앙에 하나씩 배치하여 분석 중에 초점을 맞추기 위한 추가 더미 플레이트를 준비합니다. 이전 플레이트와 마찬가지로 비강 필터로 잎 디스크를 고정하고 플레이트를 밀봉하며 실온 및 50 % 상대 습도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 이미저를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다.설정 다음에 프로토콜을 클릭하여 PAM 실험 프로토콜의 단계 입력 창을 엽니다. 원고에 제공된 기계의 기술 사양을 설정하십시오. 포화 펄스로 시작하도록 프로그램을 설정하여 지연 후 (After a Delay)라는 상자에 20 초를 입력하여 어두운 적응 광합성의 최대 양자 효율을 측정하십시오.펄스 적용 상자를 클릭하고 이 횟수라는 제목의 상자에 1을 입력합니다. 펄스 PPFD를 6, 152로, 펄스 길이를 800밀리초로 설정하고, 모든 펄스가 있는 F 프라임 및 FM 프라임 이미지 가져오기 상자를 선택합니다. 다음 삽입을 선택하여 프로토콜에 두 번째 단계를 추가합니다.지연 후 제목의 상자에 30초를 입력합니다. 그런 다음 악티닉 변경 옵션을 선택하고 Actinic PPFD라는 상자에 50을 입력하여 챔버의 광도를 50PPFD로 설정합니다. 다음에 삽입을 클릭하여 프로토콜에 새 단계를 추가하고 지연 후 라는 제목의 상자에 150초를 입력합니다.펄스 적용을 선택하고 이 횟수라는 제목의 상자에 4번을 입력하여 악티닉 라이트가 50PPFD로 유지되는 동안 150초마다 측정 펄스를 연속으로 네 번 적용합니다. 프로토콜을 원하는 위치에 pcl 파일로 저장하기 전에 원고에 제공된 값에 따라 각 단계의 지연 및 광 강도를 조정하십시오. 빛을 끄고 더미 플레이트를 샘플 스테이지에서 아래로 향하게 하여 잎의 부축 표면이 검출기를 향해 위쪽을 가리키고 스폰지가 플랫폼 쪽으로 향하도록 합니다.리프 디스크가 장비 바닥보다 140mm 위에 오도록 샘플 스테이지 높이를 설정합니다. 이미저 카메라 및 하드웨어 카메라에 연결/연결 끊기 아이콘을 클릭하여 카메라를 시작합니다. 베이스에 두 개의 녹색 선이 있는 빨간색 색상의 양면 화살표 아이콘으로 표시되는 초점 형광 기호를 클릭하고 렌즈와 노출을 조정하여 플레이트에 초점을 맞춥니다.초점 형광 아이콘을 다시 클릭하여 깜박이는 빛을 끕니다. 어둠 속에서 일하면서 더미 플레이트를 분석 할 플레이트로 교체하십시오. 오른쪽 상단 모서리의 방향을 지정하는 데 사용되는 바깥쪽에 테이프를 놓고 지도 이미지 카메라 아이콘을 클릭합니다.팝업 창의 막대가 녹색 영역에 위치할 때까지 조리개를 열거나 닫아 이미지 노출을 조정합니다. 조리개를 조정할 때마다 노출이 올바르게 조정되고 계측기가 이미지를 촬영할 때까지 다시 시도 단추를 클릭합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 격리 적용을 선택하여 배경 신호를 차단합니다.초점이 맞춰진 리프 영역은 회색으로, 배경은 파란색으로 표시됩니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지 수정 풀다운 메뉴에서 히스토그램 및 감마 레벨을 조정하여 리프 디스크만 포함시키려는 영역 또는 픽셀을 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 높고 낮은 컷 삭제를 선택하여 연한 파란색으로 강조 표시된 영역을 삭제합니다.이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스트레이 삭제를 선택하여 마지막 세 개의 다른 픽셀을 건드리지 않는 픽셀을 제거합니다. 격리된 섬으로 표시되는 이미지의 모든 영역은 별도로 분석되어 최종 데이터 출력에 포함됩니다. 프로토콜 실행 아이콘 을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.화면 하단에 타이머가 나타나 프로토콜이 실행되기까지 얼마나 오래 남았는지 알려줍니다. 프로토콜이 완료 될 때까지 기다리십시오. 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 데이터를 igr 파일로 저장합니다.다른 샘플 플레이트를 시작하기 전에 창의 오른쪽 상단에 있는 빨간색 십자선을 클릭하여 창을 닫습니다. 엽록소 형광 데이터를 내보내려면 이미징 소프트웨어에서 igr 파일을 열고 파일을 클릭 한 다음 폴더로 내보내기를 클릭하여 필요한 모든 파일이있는 새 폴더를 만듭니다. 현장에서 재배 된 콩에서 비 광화학 담금질의 전형적인 측정은 잎 디스크가 초당 미터 당 50 마이크로 몰의 낮은 빛에 노출 될 때 Fv / Fm을 결정하기 위해 초기 포화 플래시 후에 비 광화학 담금질이 하나 미만이라는 것을 보여주었습니다.또한, 초당 미터당 2, 000 마이크로몰의 높은 광으로 전달시, 비-광화학적 담금질은 15분 후에 최대 네 개까지 증가하였다. 실패한 측정은 높은 빛으로 전달 될 때 비 광화학 담금질의 최소 증가를 보였다. 이미저 내의 플레이트 방향을 정하고 리프 디스크를 샘플링하고 도금하기 위해 명확하게 정의 된 계획은 데이터가 올바른 유전자형에 연결되도록하는 데 필수적입니다.이 프로토콜은 가뭄 및 흘림과 같은 환경 변수가 비 광화학 담금질에 미치는 영향을 정량화하거나 작물 모델을 정제하기 위해 다른 캐노피 수준에서 비 광화학 담금질을 평가할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

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자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

연구

생물학

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

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High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

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수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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Bamboo의 유전자 형질전환 및 편집 방법 개발

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

저자 스포트라이트: 지속 가능한 플라스틱 대체품을 위한 대나무 잎의 유전자 편집 발전 

플란타에 위치 Moso Bamboo Leaves의 유전자 발현 및 유전자 편집

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...