Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

Эта работа поддерживается исследовательским проектом «Реализация повышенной эффективности фотосинтеза» (RIPE), который финансируется Фондом Билла и Мелинды Гейтс, Фондом исследований в области продовольствия и сельского хозяйства и Управлением иностранных дел, содружества и развития Великобритании под номером гранта OPP1172157.

1. Посадка семян
<ol><li>Выбирайте полевой участок с плодородной, хорошо дренированной, но не песчаной почвой, и с рН почти 6,5. Разметьте участки с рядами длиной 1,2 м с интервалом 0,75 м, забив землю мотыгой.</li>
	<li>Посадите 50 семян/м G.max cv. IA3023 на глубину 3 см вдоль каждого участка в н?...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis:+photosynthetic+efficiency+improvement.">Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement.</a> Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).</li><li>Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+reversibility+of+photosystem+II+thermal+energy+dissipation+on+transfer+from+high+to+low+light+may+cause+large+losses+in+carbon+gain+by+crop+canopies:+a+theoretical+analysis.">The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis.</a> Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).</li><li>Kromdijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+photosynthesis+and+crop+productivity+by+accelerating+recovery+from+photoprotection.">Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection.</a> Science. 354 (6314), 857-861 (2016).</li><li>Maxwell, K., Johnson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence-a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence-a practical guide.</a> Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Murchie, E. H., Lawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+analysis:+a+guide+to+good+practice+and+understanding+some+new+applications.">Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li><li>Bilger, W., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes,+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis.">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li><li>Li, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting.">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li><li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHOTOPROTECTION+REVISITED:+genetic+and+molecular+approaches.">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin-like/&#946;-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis.">A thioredoxin-like/&#946;-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li><li>Demmig, B., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+(77K)+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants.">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li><li>Malno&#235;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis.">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li><li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

Тщательный выбор и обращение с листовыми дисками имеют решающее значение для получения надежных измерений NPQ. Во-первых, повреждение ткани, такое как грубое обращение пинцетом, приведет к стрессу, что приведет к низким значениям максимальной квантовой эффективности фотосинтеза. Расте?...

Фотосинтез состоит из поглощения света, переноса первичных электронов, стабилизации энергии, а также синтеза и переноса продуктов фотосинтеза1. Понимание каждого шага имеет жизненно важное значение для руководства усилиями по повышению эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур. Свет влияет на скорость фотосинтеза, требуя балансировки энергоснабжения, в виде фотонов, с потребностью в уменьшении эквивалентов. Когда предложение превышает спрос, например, при сильном освещении или во время пониженной фиксацииСО2 , вызванной закрытием устьичного устьица, накопление восстановительной мощности увеличивает вероятность образования активных форм кислорода с потенциалом повреждения фотосинтетического аппарата и нарушения переноса электронов. Поэтому для предотвращения повреждений растения разработали несколько фотозащитных механизмов, включая детоксикацию активных форм кислорода и нефотохимическое гашение возбужденных хлорофилловых состояний (NPQ)2.
Поддержание высоких темпов фотосинтеза является сложной задачей в полевых условиях. Сезонные и суточные изменения, наряду с колебаниями окружающей среды, такими как вызванные ветром движения листьев и переходный облачный покров, вызывают сдвиги в количестве и интенсивности света, получаемого растениями для фотосинтеза3. NPQ рассеивает избыточную световую энергию и может помочь предотвратить повреждение фотографий, обеспечивая при этом устойчивые темпы фотосинтеза при высоком освещении4. Однако длительный NPQ во время переходов с высокой на низкую освещенность продолжает рассеивать энергию, которая может быть использована для сокращения выбросов углерода5. В результате ускорение релаксации NPQ может повысить эффективность фотосинтеза6, что делает релаксацию NPQ привлекательной целью для улучшения урожая.
Анализ флуоресценции хлорофилла (PAM) с амплитудной амплитудой может быть использован для расчета NPQ по измеримым параметрам (Дополнительная таблица 1 и Дополнительная таблица 2)7,8,9. Эта статья посвящена определению скорости релаксации NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях, с целью скрининга естественной изменчивости зародышевой плазмы. Тем не менее, флюорометрический анализ PAM хлорофилла также может быть использован для широкого спектра целей, применен к видам, начиная от водорослей до высших растений, и рассматривается в других местах 7,8,9.
В адаптированном к темноте листе или ячейке реакционные центры фотосистемы II (PSII) открыты для приема электронов, и нет NPQ. Включение измерительного света низкой интенсивности вызывает флуоресценцию хлорофилла, избегая при этом переноса электронов через PSII. Регистрируемая минимальная флуоресценция в этом адаптированном к темноте состоянии описывается параметром Fo. Применение светового импульса высокой интенсивности к адаптированному к темноте листу может быстро уменьшить первый стабильный пул акцепторов электронов хинонов, связанных с сайтом хинона А. Это временно блокирует емкость переноса электронов в реакционных центрах PSII, которые затем, как говорят, закрыты и не могут принимать электроны от расщепления воды. При использовании короткой длительности импульса недостаточно времени для стимуляции NPQ. Результирующая флуоресценция хлорофилла эквивалентна максимальному значению, получаемому при отсутствии NPQ, или максимальной флуоресценции, Fm. Разница между минимальной и максимальной флуоресценцией называется переменной флуоресценцией, Fv. Максимальный фотохимический квантовый выход фотосистемы II (Fv/Fm) вычисляется из этих двух параметров с использованием следующего уравнения:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Это может обеспечить важный показатель функции фотосистемы и напряжения. Включение актинического (фотосинтетического) света стимулирует нефотохимическое гашение, а последующее применение насыщенной вспышки позволяет измерить адаптированную к свету максимальную флуоресценцию, Fm'. Сравнивая разницу между темной и адаптированной к свету максимальной флуоресценцией, NPQ можно рассчитать в соответствии с уравнением Штерна-Вольмера10:
NPQ = Fм/Fм' - 1
В высших растениях NPQ был описан как состоящий по меньшей мере из пяти различных компонентов, включая qE, qT, qZ, qI и qH. Точные механизмы, задействованные в НПК, до конца не изучены; однако qE считается основным компонентом NPQ на большинстве заводов. Было обнаружено, что решающие факторы для полного включения qE включают накопление протонного градиента через тилакоидную мембрану, активность субъединицы фотосистемы II S11,12 и деэпоксидированные ксантофиллы, антераксантин, лютеин и, в частности, зеаксантин13. qE расслабляет быстрее всех компонентов NPQ (< 2 мин)14, и поэтому обратимая активация qE особенно важна для адаптации к изменяющейся интенсивности света. Вторая более медленная фаза релаксации NPQ (~2-30 мин) охватывает как qT, связанный с переходами состояний, так и qZ, включающий взаимопревращение зеаксантина в виолаксантин15. Медленное расслабление (> 30 мин) NPQ может включать как фотоингибаторное закалку (qI)16, так и процессы, независимые от фотоповреждения 17,18, такие как qH, которое является устойчивым закалкой в периферических усиках PSII, опосредованным пластидным липокалиновым белком 19,20.
NPQ увеличивается во время воздействия высокого света. Последующий переход на слабый свет может привести к понижению регуляции NPQ. Распад быстрой, промежуточной и медленной фаз расслабления может быть уловлен в параметрах биэкспоненциальной функции 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Теоретическая основа биэкспоненциальной функции основана на предположении об использовании первого порядка гипотетических гасячей, включая qE (Aq1), комбинированную релаксацию qZ и qT (Aq2) с соответствующими временными константами τq1 и τq2 и долгосрочный NPQ, включающий qI и фотоповреждающие независимые процессы (Aq3). Таким образом, биэкспоненциальная функция обеспечивает более реалистичное представление множественных связанных биологических процессов, участвующих в гашении флуоресценции хлорофилла, по сравнению с более простым уравнением Хилла, которое не имеет теоретической основы24.
NPQ может быть измерен с использованием различных коммерчески доступных PAM флуорометров25,26, от простых ручных устройств27 до более совершенных закрытых систем28. Однако ограничением некоторых из этих подходов является относительно низкая пропускная способность, что делает скрининг больших коллекций растений сложным без нескольких устройств и команды исследователей. Для решения этой проблемы McAusland et al. разработали процедуру, основанную на иссеченной листовой ткани, и использовали ее для выявления различий в флуоресценции хлорофилла между двумя сортами пшеницы29. Привлекательность этого подхода заключается в том, что визуализация листовых дисков, взятых из нескольких растений с помощью одного устройства, может облегчить скрининг сотен генотипов в течение дня. Это позволяет оценить вариации в релаксации NPQ в рамках исследований геномных ассоциаций или для скрининга размножающихся популяций с потенциалом повышения эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур и, в конечном счете, урожайности.
Основываясь на результатах McAusland et al.29, мы используем флуоресцентный анализ флуоресценции ПАМ хлорофилла листовых дисков для высокопроизводительного скрининга скорости релаксации NPQ в Glycine max (G.max; соя). Этот протокол использует CF Imager25, который сопоставим с другими коммерчески доступными системами закрытого PAM, такими как популярная FluorCam26. С темной комнатой для адаптации образцов пользователи могут визуализировать 96-луночные тарелки, чашки Петри и небольшие растения. Ключевым преимуществом такого подхода является увеличение пропускной способности, обеспечиваемой использованием листовых дисков по сравнению с последовательным анализом отдельных растений. Здесь мы представляем репрезентативные результаты и метод отбора проб, измерения и анализа NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

Фотосинтез не оптимизирован в современных сортах сельскохозяйственных культур, а потому дает возможность для улучшения. Ускорение релаксации нефотохимического закалки (NPQ) оказалось эффективной стратегией для повышения эффективности фотосинтеза. Тем не менее, потенциал для размножения для улучшения NPQ и полного понимания генетической основы релаксации NPQ отсутствует из-за ограничений перевыборки и сбора данных с растений, выращенных в полевых условиях. Основываясь на предыдущих отчетах, мы представляем высокопроизводительный анализ для анализа скорости релаксации NPQ в Glycine max (соя) с использованием флуорометрии хлорофилла с амплитудной амплитудой (PAM). Листовые диски отбираются из выращенных в полевых условиях соевых бобов перед транспортировкой в лабораторию, где релаксация NPQ измеряется в закрытом PAM-флуорометре. Параметры релаксации NPQ рассчитываются путем подгонки биэкспоненциальной функции к измеренным значениям NPQ после перехода от высокого к низкому освещению. Используя этот метод, можно протестировать сотни генотипов в течение дня. Эта процедура имеет потенциал для скрининга мутантных и разнообразных панелей на предмет вариаций в релаксации NPQ и, следовательно, может быть применена как к фундаментальным, так и к прикладным исследовательским вопросам.

На рисунке 1А показано типичное измерение NPQ в выращенной в полевых условиях сое. Растения были выращены в Урбане, штат Иллинойс (широта 40,084604 °, долгота -88,227952 °) летом 2021 года, с семенами, посаженными 5 июня. 2021. После 30 дней посадки семян были отобраны листовые диски, и проведены и?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Протокол вводит высокопроизводительный метод измерения релаксации нефотохимического гашения импульсно-амплитудной флюорометрией хлорофилла. Метод применяется к выращиваемому в полевых условиях Glycine max и может быть адаптирован к другим видам для скрининга генетического разнообразия или размножающихся популяций.

Высокопроизводительный анализ нефотохимического закалки сельскохозяйственных культур с использованием флуорометрии с импульсно-амплитудной модуляцией хлорофилла

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Этот метод может дать представление о генетических вариациях в нефотохимическом гашении, доступном в панелях генетического разнообразия или размножающихся популяциях. Основным преимуществом этого метода является возможность скрининга большого количества генотипов на вариации нефотохимического закалки в течение одного дня. Протокол представлен для глицина макса или сои, но может быть адаптирован для анализа других растительных пространств, из которых могут быть собраны подъемные диски.Для тех, кто выполняет протокол в первый раз, ключом является обращение с подъемным диском, чтобы предотвратить повреждение или перенасыщение губок водой. Для начала проведите отбор проб растений на полевом участке через 30 дней после прорастания. Заполните 1/3 уровня дистиллированной воды во всех колодцах плиты из 24 скважин.Пометьте крышку и боковую часть пластины репликами для отбора проб. Держите самый молодой полностью расширенный лист, присутствующий в верхней части растения, против резиновой пробки. Вдавите пробковый бур Гумбольдта номер два через лист и скрутите, чтобы разрезать диск, избегая среднего ребра.Последовательно собирайте пять дисков с одного листа для технических реплик. Вытолкните листовые диски из пробкового бура в один колодец из 24-луночной пластины с помощью ватного тампона и повторите это для другого растения того же генотипа. Убедитесь, что все листовые диски плавают в воде.Если нет, осторожно переместите листовые диски, прилипшие к боковой части колодца, в плавающее положение ватным тампоном. Переходим к дисковым образцам из следующего графика. Поместите крышку и уплотнение полупрозрачной гибкой пленкой.после завершения отбора проб во всей 24-луночной плите. Храните тарелку подальше от прямых солнечных лучей в пакете, коробке или пустом кулере. В чистом лабораторном помещении постучите по крышке герметичной пластины, чтобы выбить листовые диски, прилипшие к крышке во время транспортировки.Распакуйте пленку и снимите крышку. Перенесите листовой диск из первого положения 24-луночной плиты в свежую 96-луночную пластину с листовым диском, обращенным плоско вниз на дне колодца. Разрежьте фильтр аспиратора для носа пополам.Опустите полученный фильтр наполовину в воду и нанесите на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Вставьте фильтр в колодец с помощью листового диска для поддержания влажности. Возьмите второй листовой диск из первого положения 24-луночной плиты и поместите его лицевой стороной вниз в следующее доступное положение плиты из 96 скважин.Опустите оставшуюся половину произведенного назального фильтра в воду и смажьте его на бумажное полотенце, прежде чем вставить его в колодец со вторым листовым диском. Заклейте верхний правый угол, чтобы сориентировать пластину в темноте для визуализации. Запечатайте пластины полупрозрачной гибкой пленкой и оберните пластину в алюминиевую фольгу.Напишите идентификаторы участков и идентификатор пластины на алюминиевой фольге. Поместите пластины в темную коробку или шкаф минимум на 30 минут для расслабления первых двух фаз нефотохимического закалки. Используйте длительный темный инкубационный период за один час до визуализации, если представляют интерес долгосрочные фазы нефотохимического закалки.Подготовьте дополнительную фиктивную пластину для фокусировки во время анализа, поместив листовой диск в каждый угол свежей 96-луночной пластины и один в центре. Закрепите листовые диски с помощью носовых фильтров, как это было сделано с предыдущими пластинами, запечатайте пластину и инкубируйте в темноте при комнатной температуре и относительной влажности 50%. Включите тепловизор и откройте программное обеспечение для создания образов.Нажмите «Настройки», а затем «Протокол», чтобы открыть окно для ввода шагов в экспериментальном протоколе PAM. Установить технические характеристики машины, приведенные в рукописи. Настройте программу на запуск с насыщенного импульса для измерения максимальной квантовой эффективности адаптированного к темноте фотосинтеза, введя 20 секунд в поле с именем After a delay of.Щелкните поле Применить импульс и введите 1 в поле Под названием Это количество раз. Установите для импульса PPFD значение 6 152, длину импульса до 800 миллисекунд и установите флажок Принимать F простые и FM-изображения со всеми импульсами. Установите флажок Вставить после, чтобы добавить второй шаг в протокол.Введите 30 секунд в поле После задержки. Затем выберите опцию Изменить актиническую и введите 50 в поле под названием Actinic PPFD, чтобы установить интенсивность света в камере на уровне 50 PPFD. Нажмите кнопку Вставить после, чтобы добавить новый шаг в протокол, и введите 150 секунд в поле После задержки.Выберите Применить импульс и введите 4 в поле Под названием Это количество раз, чтобы применять измерительные импульсы каждые 150 секунд четыре раза подряд, в то время как актинический свет удерживается при 50 PPFD. Отрегулируйте задержку и интенсивность света для каждого шага в соответствии со значениями, указанными в рукописи, прежде чем сохранять протокол в виде файла pcl в нужном месте. Выключите свет и поместите фиктивную пластину лицевой стороной вниз на стадию образца так, чтобы адаксиальная поверхность листа указывала вверх к детектору, а губка была обращена вниз к платформе.Установите высоту ступени образца таким образом, чтобы листовые диски находились на 140 миллиметров выше основания инструмента. Щелкните значок подключения/отключения от фотокамеры и аппаратной камеры, чтобы запустить камеру. Щелкните символ флуоресценции фокусировки, представленный красным двусторонним значком стрелки с двумя зелеными линиями в основании, и отрегулируйте объектив и экспозицию, чтобы сфокусировать пластину.Щелкните значок флуоресценции фокусировки еще раз, чтобы выключить мигающий индикатор. Работая в темноте, замените фиктивную пластину на анализируемую пластину. Поместите его лицевой стороной вниз с лентой снаружи, используемой для ориентации в правом верхнем углу, и нажмите значок камеры с изображением карты.Отрегулируйте экспозицию изображения, открыв или закрыв диафрагму, пока панель во всплывающем окне не будет расположена в зеленой зоне. Нажимайте кнопку Try Again после каждой регулировки диафрагмы до тех пор, пока экспозиция не будет правильно отрегулирована и инструмент не получит изображение. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Применить изоляцию изображения, чтобы заблокировать фоновые сигналы.Сфокусированная область листа будет отображаться серым цветом, а фон — синим. Выберите интересующую область или пикселы, чтобы включить только листовые диски, отрегулировав гистограмму и уровень гаммы в раскрывающемся меню «Изменить изображение», щелкнув правой кнопкой мыши изображение. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Удалить высокие и низкие разрезы, чтобы удалить светло-синие выделенные области.Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Удалить отклонения, чтобы удалить все пиксели, не затрагивающие последние три других пикселя. Любые области на изображении, которые выглядят как изолированные острова, будут проанализированы отдельно и включены в окончательный вывод данных. Щелкните значок запуска протокола, чтобы запустить программу.В нижней части экрана появится таймер, сообщающий вам, сколько времени осталось для запуска протокола. Дождитесь завершения работы с протоколом. Щелкните Файл и Сохранить как, чтобы сохранить данные в виде файла igr.Закройте окно, нажав на красный крестик в правом верхнем углу окна, прежде чем запускать другую табличку с образцами. Чтобы экспортировать данные флуоресценции хлорофилла, откройте файл igr в программном обеспечении для обработки изображений и нажмите «Файл», а затем «Экспорт в папку», чтобы создать новую папку со всеми необходимыми файлами. Типичное измерение нефотохимического закалки в выращенных в полевых условиях соевых бобов показало, что после первоначальной насыщенной вспышки для определения Fv / Fm, когда листовые диски подвергались воздействию слабого света 50 микромолей на метр в секунду, нефотохимическое закалка было менее одного.Кроме того, при переходе на высокий свет 2000 микромолей в метр в секунду нефотохимическое закалка увеличивалось до максимального значения четырех через 15 минут. Неудачное измерение показало минимальное увеличение нефотохимического закалки при переходе на высокий свет. Ориентировочные пластины внутри тепловизора и четко определенный план отбора проб и покрытия листовых дисков имеют важное значение для обеспечения того, чтобы данные были связаны с правильным генотипом.Этот протокол может количественно оценить влияние экологических переменных, таких как засуха и линька, на нефотохимическое закалку или оценить нефотохимическое закалку на различных уровнях полога для уточнения моделей сельскохозяйственных культур.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Обнаружение микроРНК цели в высокой пропускной Использование 3&#39;LIFE Пробирной

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Точный, высокой пропускной способности анализ роста бактерий

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Высок объём измерения кишки транзитного времени используя личиночной данио рерио

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Оценка эффективности фотосинтеза у фотодыхающих мутантов методом флуоресцентного анализа хлорофилла

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Определение взаимосвязи между цитрусовыми и взаимоотношениями с использованием ручного опыления, микроскопии и анализа S-генотипа

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Разработка методов трансформации и редактирования генов в бамбуке

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

В центре внимания автора: Совершенствование редактирования генов в листьях бамбука для устойчивых альтернатив пластику 

В Планте Экспрессия генов и редактирование генов в листьях бамбука мосо

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...