Name: high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

Detta arbete stöds av forskningsprojektet Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) som finansieras av Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research och U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office under bidragsnummer OPP1172157.

1. Frö plantering
<ol><li>Välj en fältplats med bördig, väldränerad men inte sandjord och med ett pH på nästan 6,5. Markera 1,2 m rad tomter med 0,75 m avstånd genom att göra marken med en hacka.</li>
	<li>Plantera 50 frön/m G.max cv. IA3023 på 3 cm djup längs varje område i början av växtsäsongen när jordtemperaturen är mellan 25 och 30 °C. OBS: För screening av genetisk mångfald förväntas flera olika genotyper odlas och jämföras. Plantera 2-5 rader per genotyp ar...

<ol>
	<li>Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).</li><li>Murchie, E. H., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+photoprotection+to+improve+plant+photosynthesis.">Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis.</a> Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).</li><li>Horton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+light+harvesting+and+photoprotection:+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences.">Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).</li><li>Slattery, R. A., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis:+photosynthetic+efficiency+improvement.">Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement.</a> Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).</li><li>Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+reversibility+of+photosystem+II+thermal+energy+dissipation+on+transfer+from+high+to+low+light+may+cause+large+losses+in+carbon+gain+by+crop+canopies:+a+theoretical+analysis.">The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis.</a> Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).</li><li>Kromdijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+photosynthesis+and+crop+productivity+by+accelerating+recovery+from+photoprotection.">Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection.</a> Science. 354 (6314), 857-861 (2016).</li><li>Maxwell, K., Johnson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence-a+practical+guide.">Chlorophyll fluorescence-a practical guide.</a> Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).</li><li>Murchie, E. H., Lawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence+analysis:+a+guide+to+good+practice+and+understanding+some+new+applications.">Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li><li>Bilger, W., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+xanthophyll+cycle+in+photoprotection+elucidated+by+measurements+of+light-induced+absorbance+changes,+fluorescence+and+photosynthesis+in+leaves+of+Hedera+canariensis.">Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis.</a> Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).</li><li>Li, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pigment-binding+protein+essential+for+regulation+of+photosynthetic+light+harvesting.">A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.</a> Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).</li><li>Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHOTOPROTECTION+REVISITED:+genetic+and+molecular+approaches.">PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+fluorescence+quenching:+mechanism+and+effectiveness+in+protecting+plants+from+photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage.</a> Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+intact+chloroplasts+and+algae.+Resolution+into+two+components.">Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).</li><li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis.">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li><li>Krause, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinhibition+of+photosynthesis.+An+evaluation+of+damaging+and+protective+mechanisms.">Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms.</a> Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).</li><li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin-like/&#946;-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis.">A thioredoxin-like/&#946;-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).</li><li>Demmig, B., Bj&#246;rkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effect+of+excessive+light+on+chlorophyll+fluorescence+(77K)+and+photon+yield+of+O2+evolution+in+leaves+of+higher+plants.">Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.</a> Planta. 171 (2), 171-184 (1987).</li><li>Malno&#235;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plastid+lipocalin+LCNP+is+required+for+sustained+photoprotective+energy+dissipation+in+Arabidopsis.">The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).</li><li>Amstutz, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+short-chain+dehydrogenase-reductase+functions+in+the+relaxation+of+photoprotective+qH+in+Arabidopsis.">An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis.</a> Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).</li><li>Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+a+slowly+reversible+fluorescence+decay+component+in+the+Arabidopsis+npq4+mutant.">On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).</li><li>Chekanov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-photochemical+quenching+in+the+cells+of+the+carotenogenic+chlorophyte+Haematococcus+lacustris+under+favorable+conditions+and+under+stress.">Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).</li><li>Allorent, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+strategy+to+cope+with+high+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).</li><li>Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+analysis+of+non-photochemical+chlorophyll+fluorescence+quenching+curves:+I.+Theoretical+considerations.">On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).</li><li>Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+noninvasive+screening+for+perturbations+of+metabolism+and+plant+growth+using+chlorophyll+fluorescence+imaging.">Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging.</a> Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).</li><li>Nedbal, L., Soukupov&#225;, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trt&#237;lek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+imaging+of+chlorophyll+fluorescence+using+modulated+light.">Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light.</a> Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).</li><li>Kuhlgert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultispeQ+Beta:+a+tool+for+large-scale+plant+phenotyping+connected+to+the+open+PhotosynQ+network.">MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network.</a> Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).</li><li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+environmental+photosynthetic+imaging+reveals+emergent+phenotypes.">Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li><li>McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+procedure+utilising+chlorophyll+fluorescence+imaging+to+phenotype+dynamic+photosynthesis+and+photoprotection+in+leaves+under+controlled+gaseous+conditions.">High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions.</a> Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).</li><li>Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+non-invasive+procedure+for+quantitative+assessment+of+drought+survival+using+chlorophyll+fluorescence.">A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence.</a> Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).</li><li>Bielczynski, L. W., &#321;&#261;cki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+and+plant+age+affects+photosynthetic+performance+and+photoprotective+capacity.">Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity.</a> Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).</li><li>Niyogi, K. K., Truong, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+flexible+non-photochemical+quenching+mechanisms+that+regulate+light+harvesting+in+oxygenic+photosynthesis.">Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis.</a> Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).</li><li>Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+light+energy+distribution+upon+state+transitions:+an+in+vivo+photoacoustic+study+of+the+wild+type+and+photosynthesis+mutants+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).</li><li>Quick, W. P., Stitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+factors+contributing+to+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+in+barley+leaves.">An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).</li><li>Horton, P., Hague, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+induction+of+chlorophyll+fluorescence+in+isolated+barley+protoplasts.+IV.+Resolution+of+non-photochemical+quenching.">Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).</li></ol>

Noggrann val och hantering av bladskivor är avgörande för att få tillförlitliga mätningar av NPQ. För det första kommer skador på vävnaden, såsom grov hantering med pincett, att införa stress, vilket resulterar i låga värden för maximal kvanteffektivitet för fotosyntes. Icke-stressade växter har vanligtvis Fv / Fm-värden på cirka 0,8318, med signifikanta nedgångar som indikerar en minskning av fotosyntetisk prestanda9</s...

Fotosyntes består av ljusabsorption, primär elektronöverföring, energistabilisering, och syntes och transport av fotosyntetiska produkter1. Att förstå varje steg är avgörande för att vägleda ansträngningarna för att öka grödans fotosyntetiska effektivitet. Ljus påverkar fotosynteshastigheten, vilket kräver balansering av energiförsörjning, i form av fotoner, med efterfrågan på att minska ekvivalenter. När utbudet överstiger efterfrågan, till exempel under högt ljus eller under reducerad CO2-fixering orsakad av stomatal stängning, ökar uppbyggnaden av reducerande effekt sannolikheten för reaktiv syreartbildning med potential att skada den fotosyntetiska apparaten och försämra elektrontransporten. För att förhindra skador har växter därför utvecklat flera fotoskyddsmekanismer, inklusive avgiftning av reaktiva syrearter och icke-fotokemisk släckning av de exciterade klorofylltillstånden (NPQ)2.
Att upprätthålla höga fotosynteshastigheter är utmanande under en fältmiljö. Säsongs- och dygnsförändringar, tillsammans med miljöfluktuationer som vindinducerade bladrörelser och övergående molntäcke, orsakar förändringar i mängden och intensiteten av ljus som tas emot av växter för fotosyntes3. NPQ sprider överflödig ljusenergi och kan hjälpa till att förhindra fotoskador samtidigt som det möjliggör ihållande fotosynteshastigheter vid högt ljus4. Långvarig NPQ under övergångar i högt till svagt ljus fortsätter dock att sprida energi som kan användas för koldioxidreduktion5. Som ett resultat kan påskynda avslappningen av NPQ öka effektiviteten ifotosyntesen 6, vilket gör NPQ-avkoppling till ett attraktivt mål för förbättring av grödor.
Pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorescensanalys (PAM) kan användas för att beräkna NPQ från mätbara parametrar (tilläggstabell 1 och tilläggstabell 2)7,8,9. Denna artikel fokuserar på att bestämma NPQ-avslappningshastigheter i fältodlade växter i syfte att screena naturlig variation i bakterieplasma. PAM-klorofyllfluorometrianalys kan dock också användas för en mängd olika ändamål, tillämpas på arter som sträcker sig från alger till högre växter och granskas någon annanstans 7,8,9.
I ett mörkanpassat blad eller cell är reaktionscentra för fotosystem II (PSII) öppna för att ta emot elektroner och det finns ingen NPQ. Att slå på ett lågintensivt mätljus framkallar klorofyllfluorescens samtidigt som elektrontransport genom PSII undviks. Den registrerade minsta fluorescensen i detta mörkanpassade tillstånd beskrivs med parametern Fo. Att applicera en högintensiv ljuspuls på ett mörkanpassat blad kan snabbt minska den första stabila elektronacceptorpoolen av kinoner bundna till kinon A-platsen. Detta blockerar tillfälligt elektronöverföringskapacitet i PSII-reaktionscentra, som sedan sägs vara stängda och inte kan ta emot elektroner från vattendelning. Genom att använda en kort pulsvaraktighet finns det inte tillräckligt med tid för att stimulera NPQ. Den resulterande klorofyllfluorescensen motsvarar det maximala värdet som kan erhållas i frånvaro av NPQ, eller maximal fluorescens, Fm. Skillnaden mellan minimal och maximal fluorescens kallas variabel fluorescens, Fv. Det maximala fotokemiska kvantutbytet för fotosystem II (Fv/Fm) beräknas utifrån dessa två parametrar med hjälp av följande ekvation:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Detta kan ge en viktig indikator på fotosystemets funktion och stress. Att slå på ett aktiniskt (fotosyntetiskt) ljus stimulerar icke-fotokemisk släckning, och efterföljande applicering av en mättande blixt möjliggör mätning av ljusanpassad maximal fluorescens, Fm '. Genom att jämföra skillnaden mellan mörk och ljusanpassad maximal fluorescens kan NPQ beräknas enligt Stern-Volmer-ekvationen10:
NPQ = Fm/Fm' - 1
I högre anläggningar har NPQ beskrivits bestå av minst fem distinkta komponenter, inklusive qE, qT, qZ, qI och qH. De exakta mekanismerna för npq är inte helt klarlagda. qE anses dock vara huvudkomponenten i NPQ i de flesta anläggningar. Avgörande faktorer för fullt engagemang av qE har visat sig inkludera uppbyggnaden av en protongradient över tylakoidmembranet, aktiviteten hos fotosystem II-underenheten S 11,12 och de-epoxiderade xantofyller, antheraxantin, lutein och i synnerhet zeaxantin13. qE slappnar av snabbast av alla NPQ-komponenter (< 2 min)14, och reversibel aktivering av qE är därför särskilt viktig för anpassning till skiftande ljusintensiteter. En andra långsammare fas av NPQ-avslappning (~ 2-30 min) omfattar både qT, relaterade till tillståndsövergångar, och qZ, som involverar interkonversion av zeaxantin till violaxantin15. Långsam avslappnande (> 30 min) av NPQ kan innefatta både fotoinhibitorisk släckning (qI)16 och processer oberoende av fotoskada17,18, såsom qH, som upprätthålls släckning i de perifera antennerna av PSII medierad av ett plastidlipokalinprotein19,20.
NPQ ökar under exponering för högt ljus. Efterföljande överföring till svagt ljus kan leda till nedreglering av NPQ. Sönderfallet av snabba, mellanliggande och långsamma avslappnande faser kan fångas i parametrarna för en bi-exponentiell funktion 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Den teoretiska grunden för den bi-exponentiella funktionen är baserad på antagandet om första ordningens användning av hypotetiska släckare, inklusive qE (Aq1), den kombinerade avslappningen av qZ och qT (Aq2), med motsvarande tidskonstanter τq1 och τq2, och långsiktig NPQ, som inkluderar qI och fotoskadande oberoende processer (Aq3). Som sådan ger den bi-exponentiella funktionen en mer realistisk representation av de flera anslutna biologiska processerna som är involverade i att släcka klorofyllfluorescens jämfört med en enklare Hill-ekvation som saknar en teoretisk grund24.
NPQ kan mätas med hjälp av en mängd kommersiellt tillgängliga PAM-fluorometrar25,26, från enkla handhållna enheter27 till mer avancerade slutna system28. En begränsning av flera av dessa metoder är dock en relativt låg genomströmning, vilket gör screening av stora samlingar av växter utmanande utan flera enheter och ett team av forskare. för att ta itu med denna fråga utvecklade McAusland m.fl. ett förfarande baserat på utskuren bladvävnad och använde det för att identifiera skillnader i klorofyllfluorescens mellan två vetesorter29. Attraktionen med detta tillvägagångssätt är att avbildning av bladskivor, tagna från flera växter med en enda enhet, kan underlätta screening av hundratals genotyper inom en dag. Detta gör det möjligt att bedöma variationen i NPQ-avslappning som en del av genomomfattande associeringsstudier, eller för screening av avelspopulationer med potential att öka grödans fotosyntetiska effektivitet och i slutändan ge.
Baserat på resultaten från McAusland et al.29 använder vi PAM klorofyllfluorescensanalys av bladskivor för screening med hög genomströmning av NPQ-avslappningshastigheter i Glycine max (G.max; sojabönor). Detta protokoll använder CF Imager25, vilket är jämförbart med andra kommersiellt tillgängliga slutna PAM-system, till exempel den populära FluorCam26. Med ett mörkt rum för anpassning av prover kan användare avbilda 96-brunnsplattor, petriskålar och små växter. Den viktigaste fördelen med detta tillvägagångssätt är den ökade genomströmningen som erbjuds genom att använda bladskivor jämfört med sekventiell analys av enskilda växter. Här presenterar vi representativa resultat och en metod för provtagning, mätning och analys av NPQ i fältodlade växter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Antylia Scientific</td>
			<td>&#160;61018-56</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black marker pen</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>SAN30001</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF imager</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorophyll fluorescence imager 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork-borer, 7mm</td>
			<td>Humboldt Mfg Co</td>
			<td>H9665</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorImager V2.305 Software</td>
			<td>Technologica Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>imaging software 
			Country of Origin: United Kingdom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#160;B07P6XCTGV</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker stakes</td>
			<td>John Henry Company</td>
			<td>KN0151</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-596</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis Company Inc.</td>
			<td>&#160;S3-594-6</td>
			<td>Semi -transparent flexible film 
			Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid rubber stoppers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-130M</td>
			<td>Country of Origin: United States of America</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of non-photochemical quenching in crops using pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry

Fotosyntesen är inte optimerad i moderna grödor och ger därför möjlighet till förbättring. Att påskynda avslappningen av icke-fotokemisk släckning (NPQ) har visat sig vara en effektiv strategi för att öka fotosyntetisk prestanda. Potentialen att avla för förbättrad NPQ och en fullständig förståelse för den genetiska grunden för NPQ-avslappning saknas dock på grund av begränsningar av översampling och datainsamling från fältodlade grödor. Baserat på tidigare rapporter presenterar vi en analys med hög genomströmning för analys av NPQ-avslappningshastigheter i glycin max (sojabönor) med hjälp av pulsamplitudmodulerad (PAM) klorofyllfluorometri. Bladskivor provtas från fältodlade sojabönor före transport till ett laboratorium där NPQ-avslappning mäts i en sluten PAM-fluorometer. NPQ-avslappningsparametrar beräknas genom att anpassa en bi-exponentiell funktion till de uppmätta NPQ-värdena efter en övergång från högt till svagt ljus. Med hjälp av denna metod är det möjligt att testa hundratals genotyper inom en dag. Förfarandet har potential att screena mutant- och mångfaldspaneler för variation i NPQ-avslappning, och kan därför tillämpas på både grundläggande och tillämpade forskningsfrågor.

Figur 1A visar en typisk mätning av NPQ i fältodlad sojaböna. Växter odlades i Urbana, IL (latitud 40.084604 °, longitud -88.227952 °) under sommaren 2021, med frön planterade den 5 juni. 2021. Bladskivorna provtogs efter 30 dagars plantering av frön, och mätningar gjordes med det tillhandahållna protokollet (tabell 1). Fv/Fm - och NPQ-värden beräknades för varje bladskiva (tilläggstabell 4) och NPQ-avslappningsparametrar ber?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry at JoVE.com

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Protokollet introducerar en högkapacitetsmetod för att mäta avslappningen av icke-fotokemisk släckning genom pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri. Metoden tillämpas på fältodlad Glycine max och kan anpassas till andra arter för att screena för genetisk mångfald eller avelspopulationer.

Analys med hög genomströmning av icke-fotokemisk släckning i grödor med hjälp av pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Denna metod kan ge en inblick i den genetiska variationen i icke-fotokemisk släckning som finns inom genetiska mångfaldspaneler eller avelspopulationer. Den största fördelen med denna teknik är potentialen att screena ett stort antal genotyper för variation i icke-fotokemisk släckning inom en enda dag. Protokollet presenteras för glycin max eller sojabönor, men kan anpassas för att analysera andra växtutrymmen från vilka lyftskivor kan samlas in.För någon som utför protokollet för första gången är nyckeln att hantera lyftskivan för att förhindra skador eller övermättnadssvampar med vatten. För att börja, prova växterna på fältplatsen 30 dagar efter spiring. Fyll 1/3-nivå destillerat vatten i alla brunnar på en 24-brunnsplatta.Märk locket och sidan av plattan med de replikat som ska provtas. Håll det yngsta fullexpanderade bladet som finns på toppen av växten mot ett gummipropp. Tryck en Humboldt-korkborrare nummer två genom bladet och vrid för att klippa en skiva och undvik mittribben.Samla in fem skivor i följd från samma blad för tekniska replikat. Skjut ut bladskivorna ur korkborren i en enda brunn på en 24-brunnsplatta med en bomullspinne och upprepa detta för en annan växt av samma genotyp. Kontrollera att alla bladskivor flyter i vattnet.Om inte, flytta försiktigt bladskivor som klibbar på sidan av en brunn till ett flytande läge med en bomullspinne. Gå vidare till provtagningsskivor från följande diagram. Placera locket och försegla med en halvtransparent flexibel film.efter avslutad provtagning i hela 24-brunnsplattan. Förvara plattan i direkt solljus i en påse, låda eller tom kylare. I ett rent laboratorieutrymme trycker du på locket på den förseglade plattan för att lossa bladskivor som sitter fast på locket under transporten.Packa upp filmen och ta bort locket. Överför en bladskiva från det första läget på 24-brunnsplattan till en ny 96-brunnsplatta med bladskivan vänd platt ner i botten av brunnen. Skär ett nasalt aspiratorfilter i hälften.Doppa det resulterande filtret halvvägs i vatten och badda på en pappershandduk för att ta bort överflödig vätska. Sätt in filtret i brunnen med bladskivan för att bibehålla fuktigheten. Ta en andra bladskiva från det första läget på 24-brunnsplattan och placera den med framsidan nedåt i nästa tillgängliga position på 96-brunnsplattan.Doppa den återstående halvan av näsfiltret som produceras i vatten och badda det på en pappershandduk innan du sätter in det i brunnen med den andra bladskivan. Tejpa det övre högra hörnet för att hjälpa till att orientera plattan i mörkret för avbildning. Försegla plattor med en halvtransparent flexibel film och linda in plattan i aluminiumfolie.Skriv plot-ID och platt-ID på aluminiumfolien. Placera plattorna i en mörk låda eller skåp i minst 30 minuter för avkoppling av de två första faserna av icke-fotokemisk släckning. Använd en långvarig mörk inkubationsperiod på en timme före avbildning om långsiktiga faser av icke-fotokemisk släckning är av intresse.Förbered en extra provplatta för fokusering under analysen genom att placera en bladskiva i varje hörn av en ny 96-brunnsplatta och en i mitten. Säkra bladskivor med näsfilter som gjort med tidigare plattor, täta plattan och inkubera i mörkret vid rumstemperatur och 50% relativ luftfuktighet. Slå på avbildaren och öppna bildprogramvaran.Klicka på Inställningar följt av Protokoll för att öppna ett fönster för inmatning av steg i PAM-experimentprotokollet. Ställ in de tekniska specifikationerna för maskinen som finns i manuskriptet. Ställ in programmet så att det börjar med en mättande puls för att mäta den maximala kvanteffektiviteten för mörkanpassad fotosyntes genom att ange 20 sekunder i rutan med namnet Efter en fördröjning av.Klicka på rutan Använd puls och ange 1 i rutan med titeln Detta antal gånger. Ställ in pulsen PPFD på 6, 152, pulslängden på 800 millisekunder och markera rutan Ta F prime- och FM-primtalsbilder med alla pulser. Markera Infoga efter för att lägga till ett andra steg i protokollet.Ange 30 sekunder i rutan med titeln Efter en fördröjning av. Välj sedan alternativet Ändra aktinisk och ange 50 i rutan med titeln Actinic PPFD för att ställa in ljusintensiteten till kammaren till 50 PPFD. Klicka på Infoga efter för att lägga till ett nytt steg i protokollet och ange 150 sekunder i rutan med titeln Efter en fördröjning av.Välj Använd puls och ange 4 i rutan med titeln Detta antal gånger för att applicera mätpulser var 150: e sekund fyra gånger i rad medan det aktiniska ljuset hålls vid 50 PPFD. Justera fördröjningen och ljusintensiteten för varje steg enligt värdena i manuskriptet innan du sparar protokollet som en pcl-fil på önskad plats. Släck ljuset och placera provdockans platta med framsidan nedåt på provsteget så att bladets adaxiala yta pekar uppåt mot detektorn och att svampen är vänd nedåt mot plattformen.Ställ in provstegets höjd så att bladskivorna ligger 140 millimeter över instrumentets bas. Klicka på ikonen anslut/koppla från till bildkamera och hårdvarukamera för att starta kameran. Klicka på fokusfluorescenssymbolen, representerad av en rödfärgad, dubbelsidig pilikon med två gröna linjer vid basen, och justera linsen och exponeringen för att få plattan i fokus.Klicka på fokusfluorescensikonen igen för att stänga av den blinkande lampan. Arbeta i mörkret, byt ut provplattan med plattan som ska analyseras. Placera den med framsidan nedåt med tejpen på utsidan som används för att orientera det övre högra hörnet och klicka på kartbildskameraikonen.Justera bildexponeringen genom att öppna eller stänga bländaren tills fältet i popup-fönstret är placerat i den gröna zonen. Klicka på knappen Försök igen efter varje justering av bländaren tills exponeringen är korrekt justerad och instrumentet tar en bild. Högerklicka på bilden och välj Använd bildisolering för att blockera bakgrundssignaler.Det fokuserade bladområdet visas i grått och bakgrunden i blått. Välj det eller de pixlar som är av intresse om du bara vill inkludera bladskivorna genom att justera histogrammet och gammanivån från rullgardinsmenyn Ändra bild genom att högerklicka på bilden. Högerklicka på bilden och välj Ta bort höga och låga snitt för att ta bort de ljusblå markerade områdena.Högerklicka på bilden och välj Ta bort strö för att ta bort pixlar som inte rör de tre sista andra pixlarna. Alla områden på bilden som visas som isolerade öar analyseras separat och inkluderas i den slutliga datautmatningen. Klicka på ikonen kör protokoll för att starta programmet.En timer visas längst ner på skärmen som informerar dig om hur länge protokollet har kvar att köra. Vänta tills protokollet är klart. Klick Fil och spara som för att spara data som en igr-fil.Stäng fönstret genom att klicka på det röda korset längst upp till höger i fönstret innan du startar en annan provplatta. För att exportera klorofyllfluorescensdata, öppna igr-filen i bildprogramvaran och klicka på Arkiv följt av Exportera till mapp för att skapa en ny mapp med alla nödvändiga filer. En typisk mätning av icke-fotokemisk släckning i fältodlade sojabönor visade att efter en första mättande blixt för att bestämma Fv / Fm när bladskivorna utsattes för svagt ljus på 50 mikromol per meter per sekund, var den icke-fotokemiska släckningen mindre än en.Vidare, vid överföring till högt ljus på 2 000 mikromol per meter per sekund, ökade icke-fotokemisk släckning upp till det maximala värdet på fyra efter 15 minuter. En misslyckad mätning visade en minimal ökning av icke-fotokemisk släckning vid överföring till högt ljus. Orienteringsplattor i avbildaren och en tydligt definierad plan för provtagning och plätering av bladskivor är avgörande för att säkerställa att data är kopplade till rätt genotyp.Detta protokoll kan kvantifiera effekterna av miljövariabler som torka och utsläpp på icke-fotokemisk släckning eller utvärdera icke-fotokemisk släckning vid olika baldakinnivåer för att förfina grödmodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Upptäckt av miRNA mål i hög kapacitet Använda 3&#39;LIFE analys

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Exakt, High-throughput analys av bakterietillväxt

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Hög genomströmning mätning av Gut transittid använder Larval zebrafiskar

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Utvärdering av fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriska mutanter genom klorofyllfluorescensanalys

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Bestämning av själv-(in)kompatibilitet och inter-(in) kompatibilitetsrelationer i citrus med hjälp av manuell pollinering, mikroskopi och S-genotypanalyser

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Utveckling av gentransformation och redigeringsmetoder i bambu

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Författare i fokus: Främja genredigering i bambublad för hållbara plastalternativ 

I Planta Genuttryck och genredigering i Moso bambublad

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...