2.2K Views
•
09:10 min
•
March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
Denne protokol kan bruges til at strømline isoleringen og identifikationen af Caenorhabditis nematoder fra naturen og registrere vigtige økologiske og miljømæssige data forbundet med nematodernes naturlige miljø. De vigtigste fordele ved denne teknik er dens skalerbarhed og nøjagtighed, som er muliggjort ved at udnytte mobile dataindsamlingsplatforme, skybaserede databaser og standardiserede databehandlingsfunktioner. Til at begynde med skal du identificere et sted at undersøge Caenorhabditis nematoder.
For at oprette et Fulcrum-projekt skal du oprette en konto hos Fulcrum online ved hjælp af en gratis uddannelsesaftale og tilføje nematodefeltprøveudtagningsapplikationen. Tilsæt derefter nematodeisoleringsapplikationen. Udskriv et sæt QR-kodeetiketter som C-labels for at spore samlingerne og S-labels for at spore nematodeisolationerne.
Fastgør C-etiketterne til Ziploc plastposer til pakning. Opbevar sættet med S-labels til brug i laboratoriet. Vælg stikprøveudtagningen af nematodefeltet i rullemenuen i Fulcrum-mobilappen, og tryk på plus for at starte en ny post i projektet.
Tag et billede af substratet. Tryk på C-Label-feltet, og vælg scan. Scan stregkoden på indsamlingsposen ved hjælp af kameraet på mobilenheden, og tryk derefter på OK.
Tryk på substratfeltet, og vælg en substrattype. Mål substratets overfladetemperatur ved hjælp af berøringsfrit termometer, og registrer værdien i substrattemperaturfeltet. Mål og registrer også omgivelsestemperaturen og fugtigheden.
Gem og optag i Fulcrum ved at trykke på Gem øverst til venstre på skærmen. Saml en spiseskefuld af substratet uden pinde eller andre hårde stykker ved at vende opsamlingsposen som en handske for at samle substratet op, og forsegl derefter posen. For hver Ziploc-pose skal du notere C-etiketten på posen og fastgøre en matchende C-label til låget på en 10 centimeter plade plettet med OP50-bakterier.
Overfør en spiseskefuld prøve fra hver opsamlingspose til C-pladerne ved hjælp af en ren plastske. På Fulcrum-applikationen skal du vælge nematodeisolering fra applikationsmenuen. Lav derefter en ny isolationspost ved at trykke på plusikonet nederst til højre.
Tryk på knappen Vælg for at finde den C-label, der er knyttet til en prøve. Tryk på søgeikonet. Tryk derefter på scanningsikonet for at scanne C-Label QR-koden.
Kig efter nematoder på C-pladen med et dissekerende mikroskop. Tryk på ormene på prøvefeltet for at registrere tilstedeværelsen af nematoder på prøven. Hvis der ikke er nematoder til stede, parafilm C-pladen og bortskaffe den i en biofarebeholder.
Hvis nematoder er til stede, skal du isolere op til fem nematoder fra C-pladen og overføre hver til sin egen S-plade. Tryk derefter på feltet S-mærkede plader for at indtaste den S-plade, der bruges til denne isolering. Tryk på plusset nederst til højre.
Tryk på S-Label, og klik derefter på scan for at åbne enhedens kamera, og scan derefter S-Label QR-koden på S-pladen. Tryk på knappen Gem øverst til højre, når isolationsposten har alle oplysninger tilføjet korrekt, og parafilm derefter S-pladerne med isolerede nematoder og læg dem til side i et område, der er udpeget til at holde S-plader med nematoder. Log ind på Fulcrum-webstedet, og vælg nematodeisoleringsapplikationen.
Klik på eksportør for at downloade en zip-fil, der indeholder nematodeisolerings- s_labeled_plates. csv-fil. Naviger til den vilde isolat genoypingskabelon Google Sheet, og kopier Google Sheet.
Placer S-etiketterne kopieret fra nematodeisoleringen s_labeled_plates. csv-kolonne i genotypearket. Kontroller for prolifererende dyr på S-plader 48 timer efter isolering.
Hvis en S-plade har fremdrækkende dyr, skal du indtaste en i proliferation 48-kolonnen i genotypearket og derefter flytte S-pladen til en kasse mærket 48 timers spredningsboks en. Kontroller de S-plader, der ikke spredte sig 48 timer efter isolation igen 168 timer efter isolation. Hvis en S-plade nu breder sig, skal du indtaste en i kolonnen proliferation 168 på genotypearket og derefter flytte S-pladen til en kasse mærket 168 timers spredningsboks en.
Filtrer genotypen i Google Sheet, så den kun indeholder S-etiketterne i ét spredningsfelt, der skal lyseres, og vælg derefter kolonnerne S-Label gennem lysisnoder. Udskriv et lysisregneark for hver spredningsboks, der skal lyseres. Forbered 12 brøndstrimmelrør til prøverne, der skal lyseres.
Fjern et strimmelrør, og tilsæt otte mikroliter lysisbuffer til hver hætte med en gentagen pipetter. Vælg tre til fem dyr fra kildepladerne til de hættepositioner, der er angivet på lysisregnearket. Gentag i op til otte strimmelrør og læg strimmelrørene i fryseren minus 80 grader Celsius.
Fjern sæt af strimmelrør og kør lyserprogrammet i termocyklisten. Opbevar derefter lysaterne ved minus 80 grader Celsius i op til en uge. Fjern striprørene fra fryseren minus 80 grader Celsius og tø lysismaterialet op på is.
Mens lysismaterialet optøes, skal du forberede ITS2- og SSU-masterblandinger i separate rør på is. Tilsæt to mikroliter lysat til den relevante brønd i PCR-pladen med en flerkanalspipette med lavt volumen. Kør PCR'erne med det relevante termocyklistprogram, og registrer, hvilke S-Labels der giver ITS2- eller SSU PCR-produkter i genotikarket.
For hver prøve, der er ITS2-positiv, skal du bruge det resterende ITS2 PCR-produkt til Sanger-sekventering og hente seq-outputfilerne for hver S-label fra sekventeringsplatformen. Naviger til NBCI BLAST-webstedet i en webbrowser for at starte BLAST-søgningen. For S-pladesekvenser, der BLAST til en Caenorhabditis-art, skal du indtaste det fulde slægts- og artsnavn på det øverste BLAST-hit i kolonnen Arts-ID.
Navngiv stammerne med unikke navne i hælene på Caenorhabditis-nomenklaturkonventionerne, og indtast stammenavnene i kolonnen med stammenavnet. For at behandle dataene skal du navigere til Fulcrum-webstedet og eksportere de rå projektdata fra Fulcrum-databasen. Åbn et nyt R-script, og følg anvisningerne i easyfulcrum-vignetten for at behandle indsamlingsdataene.
I NBCI BLAST viser resultaterne for S-Label S-05554, at tophittet er Caenorhabditis briggsae. Derudover kræver nogle isolerede nematoder yderligere indsats for at genotype. For eksempel undlader ca. 2% af isolaterne at forstærke med SSU PCR-primeren indstillet efter det første lysisforsøg og skal stole på for at sikre, at lysismaterialet er egnet til forstærkning med ITS2-primersættet.
Efter denne procedure kan forskere undersøge de økologiske og miljømæssige data, der er forbundet med vilde nematodeisolater for at identificere steder og substrategenskaber, der mest sandsynligt har specifikke nematodearter.
Denne protokol kan bruges til at udføre store økologiske undersøgelser af selfing Caenorhabditis nematoder. Den primære fordel ved denne metode er den effektive organisering og analyse af økologiske og molekylære data forbundet med nematoderne indsamlet fra naturen.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved