2.2K Views
•
09:10 min
•
March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
Dit protocol kan worden gebruikt om de isolatie en identificatie van Caenorhabditis-nematoden uit de natuur te stroomlijnen en belangrijke ecologische en milieugegevens vast te leggen die verband houden met de natuurlijke omgeving van de nematoden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de schaalbaarheid en nauwkeurigheid, die mogelijk worden gemaakt door gebruik te maken van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en gestandaardiseerde gegevensverwerkingsfuncties. Identificeer om te beginnen een locatie om Caenorhabditis-nematoden te onderzoeken.
Om een Fulcrum-project aan te maken, maakt u online een account aan bij Fulcrum met behulp van een gratis educatieve overeenkomst en voegt u de toepassing voor veldbemonstering van nematoden toe. Voeg vervolgens de nematode-isolatietoepassing toe. Druk een set QR-codelabels af als C-labels om de collecties te volgen en S-labels om de nematode-isolaties te volgen.
Bevestig de C-labels aan ziploc plastic zakken voor verpakking. Bewaar de set S-labels voor gebruik in het laboratorium. Selecteer de bemonstering van het aaltjesveld in het vervolgkeuzemenu van de mobiele Fulcrum-app en druk op plus om een nieuwe record in het project te starten.
Maak een foto van het substraat. Tik op het veld C-Label en kies scannen. Scan de streepjescode op de verzameltas met de camera van het mobiele apparaat en tik vervolgens op Gereed.
Tik op het substraatveld en selecteer een substraattype. Meet de oppervlaktetemperatuur van het substraat met de contactloze thermometer en noteer de waarde in het substraattemperatuurveld. Meet en registreer ook de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid.
Opslaan en opnemen in Fulcrum door linksboven in het scherm op opslaan te tikken. Verzamel een eetlepel van het substraat zonder stokjes of andere harde stukken door de verzamelzak om te keren als een handschoen om het substraat op te pakken en sluit de zak vervolgens af. Noteer voor elke Ziploc-zak het C-label op de zak en bevestig een bijpassend C-label aan het deksel van een plaat van 10 centimeter die is gespot met OP50-bacteriën.
Breng een eetlepel monster van elke verzamelzak over op de C-platen met behulp van een schone plastic lepel. Kies in de fulcrum-toepassing nematode-isolatie in het toepassingsmenu. Maak vervolgens een nieuwe isolatierecord door op het pluspictogram rechtsonder te tikken.
Tik op de selectieknop om het C-label te vinden dat aan een monster is gekoppeld. Tik op het zoekpictogram. Tik vervolgens op het scanpictogram om de C-Label QR-code te scannen.
Zoek naar nematoden op de C-plaat met een ontleedmicroscoop. Tik op de wormen op het monsterveld om de aanwezigheid van nematoden op het monster te registreren. Als er geen nematoden aanwezig zijn, parafilm dan de C-plaat en gooi deze weg in een biohazard bak.
Als er nematoden aanwezig zijn, isoleer dan maximaal vijf nematoden uit de C-plaat en breng elk over op zijn eigen S-plaat. Tik vervolgens op het veld met S-gelabelde platen om de S-plaat in te voeren die voor deze isolatie wordt gebruikt. Tik op de plus rechtsonder.
Tik op S-Label en klik vervolgens op scannen om de camera van het apparaat te openen en scan vervolgens de S-Label QR-code op de S-plaat. Tik op de opslagknop rechtsboven zodra alle informatie correct is toegevoegd aan het isolatierecord, parafilm vervolgens de S-S-platen met geïsoleerde nematoden en zet ze opzij in een gebied dat is aangewezen om S-platen met nematoden te houden. Meld u aan bij de Fulcrum-website en selecteer de toepassing voor nematode-isolatie.
Klik op exporteren om een zip-bestand te downloaden dat de nematode-isolatie s_labeled_plates bevat. csv-bestand. Navigeer naar de wild isolaat genotypering sjabloon Google Sheet en kopieer de Google Sheet.
Plaats de S-Labels gekopieerd van de nematode isolatie s_labeled_plates. csv-kolom in het genotyperingsblad. Controleer 48 uur na isolatie op woekerende dieren op S-platen.
Als een S-plaat woekerende dieren heeft, voert u er een in de kolom proliferatie 48 in het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label 48 uur proliferatiedoos één. Controleer de S-platen die zich 48 uur na isolatie niet verspreidden na 168 uur na isolatie opnieuw. Als een S-plaat zich nu vermenigvuldigt, voert u er een in de kolom proliferatie 168 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label 168 uur proliferatievak één.
Filter het genotype in Google Spreadsheet om alleen de S-labels op te nemen in één proliferatievak dat moet worden gelyseerd en selecteer vervolgens de kolommen S-Label via lysis-knooppunten. Druk een lysis-werkblad af voor elke proliferatiedoos die moet worden gelyseerd. Bereid 12 buisjes voor op de te lyseren monsters.
Maak één stripbuis los en voeg acht microliter lysisbuffer toe aan elke dop met een repeat pipetter. Kies drie tot vijf dieren uit de bronplaten in de dopposities die op het lysis-werkblad worden aangegeven. Herhaal dit gedurende maximaal acht stripbuizen en plaats de stripbuizen in de vriezer van min 80 graden Celsius.
Verwijder de sets stripbuizen en voer het lysisprogramma uit in de thermocycler. Bewaar de lysaten vervolgens maximaal een week bij min 80 graden Celsius. Haal de stripbuizen uit de vriezer van min 80 graden Celsius en ontdooi het lysismateriaal op ijs.
Terwijl het lysismateriaal ontdooit, bereidt u ITS2- en SSU-mastermixen in afzonderlijke buizen op ijs. Voeg twee microliter lysaat toe aan de juiste put in de PCR-plaat met een meerkanaalspipet met een laag volume. Voer de PCR's uit met het juiste thermocyclerprogramma en noteer welke S-Labels ITS2- of SSU PCR-producten opleveren in het genotyperingsblad.
Gebruik voor elk monster dat ITS2-positief is het resterende ITS2 PCR-product voor Sanger-sequencing en verkrijg de seq-uitvoerbestanden voor elk S-Label van het sequencingplatform. Navigeer naar de NBCI BLAST-website in een webbrowser om de BLAST-zoekopdracht te starten. Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een Caenorhabditis-soort knallen, voert u de volledige geslachts- en soortnaam van de top BLAST-hit in de kolom species ID in.
Geef de stammen een unieke naam, volgens de nomenclatuurconventies van Caenorhabditis en voer de stamnamen in de kolom stamnaam in. Om de gegevens te verwerken, navigeert u naar de Fulcrum-website en exporteert u de onbewerkte projectgegevens uit de Fulcrum-database. Open een nieuw R-script en volg de aanwijzingen in het easyfulcrum-vignet om de verzamelgegevens te verwerken.
In NBCI BLAST laten de resultaten voor S-Label S-05554 zien dat de tophit Caenorhabditis briggsae is. Bovendien vereisen sommige geïsoleerde nematoden extra inspanning om te genotyperen. Ongeveer 2% van de isolaten wordt bijvoorbeeld niet versterkt met de SSU PCR-primerset na de eerste lysispoging en moet worden vertrouwd om ervoor te zorgen dat het lysismateriaal geschikt is voor versterking met de ITS2-primerset.
Na deze procedure kunnen onderzoekers de ecologische en milieugegevens verkennen die verband houden met isolaten van wilde nematoden om locaties en substraatkenmerken te identificeren die het meest waarschijnlijk specifieke nematodensoorten herbergen.
Dit protocol kan worden gebruikt om grootschalige ecologische onderzoeken uit te voeren van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden . Het belangrijkste voordeel van deze methode is de efficiënte organisatie en analyse van ecologische en moleculaire gegevens die verband houden met de nematoden die uit de natuur zijn verzameld.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved