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March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रकृति से केनोरहाब्डिटिस नेमाटोड के अलगाव और पहचान को सुव्यवस्थित करने और नेमाटोड के प्राकृतिक वातावरण से जुड़े महत्वपूर्ण पारिस्थितिक और पर्यावरणीय डेटा को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक के मुख्य लाभ इसकी स्केलेबिलिटी और सटीकता हैं, जो मोबाइल डेटा संग्रह प्लेटफ़ॉर्म, क्लाउड-आधारित डेटाबेस और मानकीकृत डेटा प्रोसेसिंग फ़ंक्शंस का लाभ उठाकर संभव बनाए जाते हैं। शुरू करने के लिए, Caenorhabditis सूत्रकृमि का सर्वेक्षण करने के लिए एक स्थान की पहचान करें।
एक Fulcrum परियोजना बनाने के लिए, एक कोई लागत शैक्षिक समझौते का उपयोग कर Fulcrum ऑनलाइन के साथ एक खाता बनाने के लिए और सूत्रकृमि क्षेत्र नमूना आवेदन जोड़ें. फिर नेमाटोड अलगाव आवेदन जोड़ें। नेमाटोड अलगाव को ट्रैक करने के लिए संग्रह और S-लेबल को ट्रैक करने के लिए C-लेबल के रूप में QR कोड लेबल्स का एक सेट मुद्रित करें.
पैकिंग के लिए ज़िपलॉक प्लास्टिक बैग के लिए सी-लेबल संलग्न करें। प्रयोगशाला में उपयोग के लिए एस-लेबल का सेट रखें। फुलक्रम मोबाइल ऐप के ड्रॉपडाउन मेनू से नेमाटोड फ़ील्ड सैंपलिंग का चयन करें और प्रोजेक्ट में एक नया रिकॉर्ड शुरू करने के लिए प्लस दबाएं।
सब्सट्रेट की एक तस्वीर लें। सी-लेबल फ़ील्ड पर टैप करें और स्कैन चुनें। मोबाइल डिवाइस कैमरे का उपयोग करके संग्रह बैग पर बारकोड को स्कैन करें, फिर किया टैप करें।
सब्सट्रेट फ़ील्ड पर टैप करें और सब्सट्रेट प्रकार का चयन करें। गैर-संपर्क थर्मामीटर का उपयोग करके सब्सट्रेट की सतह के तापमान को मापें और सब्सट्रेट तापमान क्षेत्र में मूल्य रिकॉर्ड करें। इसके अलावा मापने और परिवेश के तापमान और आर्द्रता रिकॉर्ड.
सहेजें और स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर सहेजें पर टैप करके Fulcrum में रिकॉर्ड करें। सब्सट्रेट लेने के लिए दस्ताने के रूप में संग्रह बैग को उलटकर छड़ें या अन्य कठिन टुकड़ों के बिना सब्सट्रेट का एक बड़ा चम्मच इकट्ठा करें, फिर बैग को सील करें। प्रत्येक ज़िपलॉक बैग के लिए, बैग पर सी-लेबल पर ध्यान दें और OP50 बैक्टीरिया के साथ देखी गई 10 सेंटीमीटर प्लेट के ढक्कन पर एक मिलान सी-लेबल संलग्न करें।
एक साफ प्लास्टिक चम्मच का उपयोग करके सी-प्लेटों में प्रत्येक संग्रह बैग से नमूने का एक बड़ा चम्मच स्थानांतरित करें। Fulcrum आवेदन पर, आवेदन मेनू से सूत्रकृमि अलगाव चुनें। फिर निचले दाईं ओर प्लस आइकन को टैप करके एक नया अलगाव रिकॉर्ड बनाएं।
एक नमूने के साथ जुड़े सी-लेबल को खोजने के लिए चयन बटन पर टैप करें। खोज आइकन पर टैप करें। फिर सी-लेबल क्यूआर कोड को स्कैन करने के लिए स्कैन आइकन पर टैप करें।
एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ सी-प्लेट पर नेमाटोड की तलाश करें। नमूना पर नेमाटोड की उपस्थिति रिकॉर्ड करने के लिए नमूना क्षेत्र पर कीड़े पर टैप करें। यदि कोई नेमाटोड मौजूद नहीं हैं, तो सी-प्लेट को पैराफिल्म करें और इसे बायोहैजार्ड बिन में निपटाएं।
यदि नेमाटोड मौजूद हैं, तो सी-प्लेट से पांच नेमाटोड तक को अलग करें और प्रत्येक को अपनी एस-प्लेट में स्थानांतरित करें। इसके बाद, इस अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली एस-प्लेट में प्रवेश करने के लिए एस-लेबल प्लेट्स फ़ील्ड पर टैप करें। निचले दाईं ओर प्लस पर टैप करें।
एस-लेबल पर टैप करें और फिर डिवाइस कैमरा खोलने के लिए स्कैन पर क्लिक करें, फिर एस-प्लेट पर एस-लेबल क्यूआर कोड को स्कैन करें। ऊपरी दाईं ओर सहेजें बटन पर टैप करें एक बार जब अलगाव रिकॉर्ड में सभी जानकारी सही ढंग से जोड़ी जाती है, तो अलग-थलग नेमाटोड के साथ द-एस प्लेटों को पैराफिल्म करें और उन्हें नेमाटोड के साथ एस-प्लेटों को पकड़ने के लिए नामित क्षेत्र में अलग रखें। Fulcrum वेबसाइट में साइन इन करें और नेमाटोड अलगाव आवेदन का चयन करें।
एक ज़िप फ़ाइल है कि सूत्रकृमि अलगाव s_labeled_plates शामिल हैं डाउनलोड करने के लिए निर्यातक पर क्लिक करें। csv फ़ाइल. जंगली अलग जीनोटाइपिंग टेम्पलेट Google शीट पर नेविगेट करें और Google शीट की प्रतिलिपि बनाएँ.
सूत्रकृमि अलगाव से कॉपी किए गए एस-लेबल को s_labeled_plates रखें। जीनोटाइपिंग शीट में csv स्तंभ. अलगाव के 48 घंटे बाद एस-प्लेटों पर जानवरों को फैलाने के लिए जांच करें।
यदि एक एस-प्लेट में जानवरों का प्रसार होता है, तो जीनोटाइपिंग शीट में प्रसार 48 कॉलम में से एक दर्ज करें, फिर एस-प्लेट को 48 घंटे के प्रसार बॉक्स एक लेबल वाले बॉक्स में ले जाएं। उन एस-प्लेटों की जांच करें जो 48 घंटे के बाद अलगाव के बाद 168 घंटे में फिर से 168 घंटे के बाद अलगाव में नहीं फैल रहे थे। यदि एक एस-प्लेट अब फैल रही है, तो जीनोटाइपिंग शीट पर प्रसार 168 कॉलम में से एक दर्ज करें और फिर एस-प्लेट को 168 घंटे के प्रसार बॉक्स एक लेबल वाले बॉक्स में ले जाएं।
Google पत्रक में जीनोटाइप को फ़िल्टर करें ताकि एक प्रसार बॉक्स में केवल S-Labels को शामिल किया जा सके, फिर lysis नोड्स के माध्यम से स्तंभ S-Label का चयन करें. प्रत्येक प्रसार बॉक्स को लाइसेड करने के लिए एक लाइसिस कार्यपत्रक मुद्रित करें. नमूनों को lysed किया जा करने के लिए 12 अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब तैयार करें।
एक पट्टी ट्यूब uncap और एक दोहराने पिपेटर के साथ प्रत्येक टोपी के लिए लाइसिस बफर के आठ microliters जोड़ें. लाइसिस वर्कशीट पर इंगित कैप पदों में स्रोत प्लेटों से तीन से पांच जानवरों को चुनें। आठ स्ट्रिप ट्यूबों तक के लिए दोहराएं और स्ट्रिप ट्यूबों को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
स्ट्रिप ट्यूबों के सेट को निकालें और थर्मोसाइकलर में लाइसिस प्रोग्राम चलाएं। फिर लीसेट को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर एक हफ्ते तक स्टोर करें। माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से स्ट्रिप ट्यूबों को हटा दें और बर्फ पर लाइसिस सामग्री को पिघलाएं।
जबकि लाइसिस सामग्री पिघल रही है, बर्फ पर अलग-अलग ट्यूबों में ITS2 और SSU मास्टर मिश्रण तैयार करें। एक कम मात्रा बहु चैनल पिपेट के साथ पीसीआर प्लेट में उचित अच्छी तरह से करने के लिए lysate के दो microliters जोड़ें। उपयुक्त thermocycler कार्यक्रम के साथ PCRs चलाएँ और रिकॉर्ड जो S-Labels जीनोटाइपिंग शीट में ITS2 या SSU PCR उत्पादों उपज.
ITS2 सकारात्मक है जो प्रत्येक नमूने के लिए, Sanger अनुक्रमण के लिए शेष ITS2 PCR उत्पाद का उपयोग करें और अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म से प्रत्येक S-लेबल के लिए seq आउटपुट फ़ाइलें प्राप्त करें। ब्लास्ट खोज शुरू करने के लिए एक वेब ब्राउज़र में NBCI ब्लास्ट वेबसाइट पर नेविगेट करें। एस प्लेट अनुक्रमों के लिए कि एक Caenorhabditis प्रजातियों के लिए ब्लास्ट, प्रजातियों आईडी कॉलम में शीर्ष ब्लास्ट हिट के पूर्ण जीनस और प्रजातियों का नाम दर्ज करें।
Caenorhabditis नामकरण सम्मेलनों के बाद अद्वितीय नामों के साथ उपभेदों का नाम दें और तनाव नाम स्तंभ में तनाव नाम दर्ज करें। डेटा को संसाधित करने के लिए, Fulcrum वेबसाइट पर नेविगेट करें और Fulcrum डेटाबेस से कच्चे प्रोजेक्ट डेटा को निर्यात करें। एक नई आर स्क्रिप्ट खोलें और संग्रह डेटा को संसाधित करने के लिए easyfulrum विगनेट में निर्देशों का पालन करें।
NBCI ब्लास्ट में, S-Label S-05554 के लिए परिणाम बताते हैं कि शीर्ष हिट Caenorhabditis briggsae है। इसके अतिरिक्त, कुछ अलग-थलग नेमाटोड को जीनोटाइप के लिए अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, लगभग 2% आइसोलेट्स पहले लाइसिस प्रयास के बाद एसएसयू पीसीआर प्राइमर सेट के साथ बढ़ाने में विफल रहते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए भरोसा किया जाना चाहिए कि लाइसिस सामग्री आईटीएस 2 प्राइमर सेट के साथ प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है।
इस प्रक्रिया के बाद, शोधकर्ता जंगली सूत्रकृमि से जुड़े पारिस्थितिक और पर्यावरणीय डेटा का पता लगा सकते हैं ताकि उन स्थानों और सब्सट्रेट विशेषताओं की पहचान की जा सके जो विशिष्ट सूत्रकृमि प्रजातियों को आश्रय देने की सबसे अधिक संभावना रखते हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग बड़े पैमाने पर पारिस्थितिक सर्वेक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड को स्व-करने के लिए किया जाता है। इस विधि का प्राथमिक लाभ प्रकृति से एकत्र किए गए नेमाटोड से जुड़े पारिस्थितिक और आणविक डेटा का कुशल संगठन और विश्लेषण है।
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