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09:10 min
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March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
Questo protocollo può essere utilizzato per semplificare l'isolamento e l'identificazione dei nematodi Caenorhabditis dalla natura e registrare importanti dati ecologici e ambientali associati all'ambiente naturale dei nematodi. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua scalabilità e precisione, che sono rese possibili sfruttando piattaforme mobili di raccolta dati, database basati su cloud e funzioni di elaborazione dati standardizzate. Per iniziare, identificare una posizione per esaminare i nematodi caenorhabditis.
Per creare un progetto Fulcrum, crea un account con Fulcrum online utilizzando un accordo educativo gratuito e aggiungi l'applicazione di campionamento sul campo dei nematodi. Quindi aggiungere l'applicazione di isolamento dei nematodi. Stampa una serie di etichette con codice QR come C-Labels per tenere traccia delle collezioni e S-Labels per tracciare gli isolamenti dei nematodi.
Attaccare le etichette C ai sacchetti di plastica Ziploc per l'imballaggio. Conservare il set di S-Label per l'uso in laboratorio. Seleziona il campionamento del campo nematode dal menu a discesa dell'app mobile Fulcrum e premi più per avviare un nuovo record nel progetto.
Scatta una foto del substrato. Tocca il campo C-Label e scegli scansione. Scansiona il codice a barre sul sacchetto di raccolta utilizzando la fotocamera del dispositivo mobile, quindi tocca Fine.
Toccare il campo del substrato e selezionare un tipo di substrato. Misurare la temperatura superficiale del substrato utilizzando il termometro senza contatto e registrare il valore nel campo della temperatura del substrato. Misurare e registrare anche la temperatura e l'umidità ambiente.
Salva e registra in Fulcrum toccando Salva in alto a sinistra dello schermo. Raccogli un cucchiaio del substrato senza bastoncini o altri pezzi duri invertendo il sacchetto di raccolta come un guanto per raccogliere il substrato, quindi sigilla il sacchetto. Per ogni borsa Ziploc, annotare la C-Label sulla borsa e attaccare una C-Label corrispondente al coperchio di una piastra da 10 centimetri macchiata di batteri OP50.
Trasferire un cucchiaio di campione da ogni sacchetto di raccolta alle piastre C usando un cucchiaio di plastica pulito. Nell'applicazione Fulcrum, scegliere isolamento nematodi dal menu dell'applicazione. Quindi crea un nuovo record di isolamento toccando l'icona più in basso a destra.
Tocca il pulsante di selezione per trovare l'etichetta C associata a un campione. Tocca l'icona di ricerca. Quindi toccare l'icona di scansione per eseguire la scansione del codice QR C-Label.
Cerca i nematodi sulla piastra C con un microscopio di dissezione. Toccare i vermi sul campo campione per registrare la presenza di nematodi sul campione. Se non sono presenti nematodi, parafilmare la piastra C e smaltirla in un bidone a rischio biologico.
Se sono presenti nematodi, isolare fino a cinque nematodi dalla piastra C e trasferire ciascuno alla propria piastra S. Quindi, toccare il campo piastre con etichetta S per inserire la piastra S utilizzata per questo isolamento. Tocca il più in basso a destra.
Tocca S-Label e quindi fai clic su scansione per aprire la fotocamera del dispositivo, quindi scansiona il codice QR S-Label sulla piastra S. Tocca il pulsante salva in alto a destra una volta che il record di isolamento ha aggiunto correttamente tutte le informazioni, quindi parafilma le piastre S con nematodi isolati e mettile da parte in un'area designata per contenere piastre S con nematodi. Accedi al sito web di Fulcrum e seleziona l'applicazione per l'isolamento dei nematodi.
Fare clic su exporter per scaricare un file zip che contiene l'isolamento del nematode s_labeled_plates. csv. Passa al modello di genotipizzazione isolato selvaggio Foglio Google e copia il Foglio Google.
Posizionare le S-Label copiate dall'isolamento del nematode s_labeled_plates. csv nel foglio di genotipizzazione. Verificare la presenza di animali proliferanti su piastre S 48 ore dopo l'isolamento.
Se una piastra S ha animali proliferanti, inseriscine una nella colonna di proliferazione 48 nel foglio di genotipizzazione, quindi sposta la piastra S in una scatola etichettata 48 ore di proliferazione scatola uno. Controllare le piastre S che non proliferavano a 48 ore dopo l'isolamento di nuovo a 168 ore dopo l'isolamento. Se una piastra S sta proliferando, inseriscine una nella colonna di proliferazione 168 sul foglio di genotipizzazione e quindi sposta la piastra S in una scatola etichettata 168 ore di proliferazione box one.
Filtra il genotipo in Foglio Google per includere solo le S-Labels in una casella di proliferazione da lisare, quindi seleziona le colonne S-Label attraverso i nodi di lisi. Stampare un foglio di lavoro di lisi per ogni scatola di proliferazione da lisare. Preparare 12 tubi di striscia di pozzetto per i campioni da lisare.
Scomporre un tubo di striscia e aggiungere otto microlitri di tampone di lisi a ciascun tappo con un pipetter ripetuto. Scegli da tre a cinque animali dalle piastre di origine nelle posizioni del cappuccio indicate sul foglio di lavoro della lisi. Ripetere per un massimo di otto tubi di striscia e posizionare i tubi di striscia nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Rimuovere i set di tubi a strisce ed eseguire il programma di lisi nel termociclatore. Quindi conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius per un massimo di una settimana. Rimuovere i tubi della striscia dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelare il materiale di lisi sul ghiaccio.
Mentre il materiale di lisi si sta scongelando, preparare le miscele master ITS2 e SSU in tubi separati su ghiaccio. Aggiungere due microlitri di lisato al pozzo appropriato nella piastra PCR con una pipetta multicanale a basso volume. Eseguire le PCR con il programma di termociclatori appropriato e registrare quali S-Label producono prodotti ITS2 o SSU PCR nel foglio di genotipizzazione.
Per ogni campione positivo all'ITS2, utilizzare il restante prodotto ITS2 PCR per il sequenziamento Sanger e ottenere i file di output seq per ogni S-Label dalla piattaforma di sequenziamento. Passare al sito Web NBCI BLAST in un browser Web per iniziare la ricerca BLAST. Per le sequenze di piastre S che BLAST a una specie di Caenorhabditis, inserisci il genere completo e il nome della specie del BLAST superiore colpito nella colonna ID specie.
Assegnare un nome ai ceppi con nomi univoci, seguendo le convenzioni di nomenclatura caenorhabditis e immettere i nomi dei ceppi nella colonna del nome del ceppo. Per elaborare i dati, accedere al sito Web Fulcrum ed esportare i dati grezzi del progetto dal database Fulcrum. Aprire un nuovo script R e seguire le istruzioni nella vignetta easyfulcrum per elaborare i dati di raccolta.
In NBCI BLAST, i risultati di S-Label S-05554 mostrano che il primo successo è Caenorhabditis briggsae. Inoltre, alcuni nematodi isolati richiedono uno sforzo aggiuntivo per il genotipo. Ad esempio, circa il 2% degli isolati non riesce ad amplificare con il set di primer SSU PCR dopo il primo tentativo di lisi e deve essere fatto affidamento per garantire che il materiale di lisi sia adatto per l'amplificazione con il set di primer ITS2.
Seguendo questa procedura, i ricercatori possono esplorare i dati ecologici e ambientali associati agli isolati di nematodi selvatici per identificare le posizioni e le caratteristiche del substrato che hanno maggiori probabilità di ospitare specifiche specie di nematodi.
Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire indagini ecologiche su larga scala dei nematodi Caenorhabditis selfing. Il vantaggio principale di questo metodo è l'organizzazione efficiente e l'analisi dei dati ecologici e molecolari associati ai nematodi raccolti dalla natura.
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