このプロトコルは、自然からのCaenorhabditis線虫の単離および同定を合理化し、線虫の自然環境に関連する重要な生態学的および環境的データを記録するために使用することができる。この手法の主な利点は、モバイルデータ収集プラットフォーム、クラウドベースのデータベース、および標準化されたデータ処理機能を活用することで可能になるスケーラビリティと精度です。まず、Caenorhabditis線虫を調査する場所を特定します。
Fulcrum プロジェクトを作成するには、無償の教育契約を使用して Fulcrum のアカウントをオンラインで作成し、線虫フィールド サンプリング アプリケーションを追加します。次に、線虫分離アプリケーションを追加します。一連のQRコードラベルをCラベルとして印刷してコレクションを追跡し、Sラベルを印刷して線虫の分離を追跡します。
Cラベルをジップロックのビニール袋に貼り付けて梱包します。実験室で使用するためにSラベルのセットを保管してください。Fulcrum モバイルアプリのドロップダウンメニューから線虫フィールドのサンプリングを選択し、プラスを押してプロジェクトで新しいレコードを開始します。
基板の写真を撮ります。Cラベルフィールドをタップし、スキャンを選択します。モバイルデバイスのカメラを使用してコレクションバッグのバーコードをスキャンし、[完了] をタップします。
基板フィールドをタップし、基板タイプを選択します。非接触温度計を用いて基板の表面温度を測定し、その値を基板温度フィールドに記録する。また、周囲の温度と湿度を測定して記録します。
画面左上の[保存]をタップして、フルクラムで保存して記録します。収集袋を手袋として反転させて、スティックやその他の硬い破片なしで大さじ1杯の基板を集めて基板を拾い上げ、袋を密封します。各ジップロックバッグについて、バッグのCラベルを書き留め、OP50細菌が付着した10センチメートルのプレートの蓋に一致するCラベルを貼り付けます。
各収集袋からサンプル大さじ1杯を清潔なプラスチックスプーンを使用してCプレートに移します。Fulcrum アプリケーションで、アプリケーションメニューから線虫分離を選択します。次に、右下のプラスアイコンをタップして、新しい分離レコードを作成します。
選択ボタンをタップすると、サンプルに関連付けられているCラベルが検索されます。検索アイコンをタップします。次に、スキャンアイコンをタップしてCラベルQRコードをスキャンします。
解剖顕微鏡でCプレート上の線虫を探します。サンプルフィールド上のワームをタップして、サンプル上の線虫の存在を記録します。線虫が存在しない場合は、Cプレートをパラフィルムし、バイオハザードビンに処分します。
線虫が存在する場合は、Cプレートから最大5つの線虫を単離し、それぞれを独自のSプレートに移す。次に、[Sラベルプレート]フィールドをタップして、この絶縁に使用するSプレートを入力します。右下のプラスをタップします。
Sラベルをタップし、スキャンをクリックしてデバイスのカメラを開き、SプレートのSラベルQRコードをスキャンします。隔離記録にすべての情報が正しく追加されたら、右上の保存ボタンをタップしてから、孤立した線虫でSプレートをパラフィルムし、線虫のSプレートを保持するように指定された領域に脇に置いておきます。Fulcrum Web サイトにサインインし、線虫分離アプリケーションを選択します。
エクスポーターをクリックして、線虫分離s_labeled_platesを含むzipファイルをダウンロードします。csv ファイル。野生の分離ジェノタイピングテンプレートGoogleシートに移動し、Googleスプレッドシートをコピーします。
線虫分離s_labeled_platesからコピーしたSラベルを配置します。csv 列をジェノタイピングシートに挿入します。隔離後48時間でSプレート上で増殖している動物を確認します。
Sプレートに増殖動物がいる場合は、ジェノタイピングシートの増殖48列に1つを入力し、Sプレートを48時間増殖ボックス1とラベル付けされたボックスに移動します。単離後48時間で増殖しなかったSプレートを、単離後168時間で再度確認してください。現在 S プレートが増殖している場合は、ジェノタイピング シートの [増殖 168] 列に 1 つを入力し、S プレートを 168 時間増殖ボックス 1 というラベルの付いたボックスに移動します。
Google スプレッドシートで遺伝子型をフィルタリングして、溶解する 1 つの増殖ボックスに S ラベルのみを含め、溶解ノードを介して列 S-ラベルを選択します。溶解する増殖ボックスごとに溶解ワークシートを印刷します。溶解するサンプル用に12ウェルストリップチューブを準備します。
1本のストリップチューブのキャップを外し、繰り返しピペッターで各キャップに8マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。ソースプレートから3〜5匹の動物を溶解ワークシートに示されたキャップ位置に選びます。最大8本のストリップチューブについて繰り返し、ストリップチューブをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。
ストリップチューブのセットを取り出し、サーモサイクラーで溶解プログラムを実行します。その後、溶解物を摂氏マイナス80度で最大1週間保管する。マイナス80°Cの冷凍庫からストリップチューブを取り出し、溶解材料を氷上で解凍する。
溶解材料が融解している間に、ITS2およびSSUマスターミックスを氷上の別々のチューブで調製する。2マイクロリットルの溶解液を、少量のマルチチャンネルピペットでPCRプレート内の適切なウェルに加えます。適切なサーモサイクラープログラムでPCRを実行し、どのSラベルがITS2またはSSU PCR産物をジェノタイピングシートに生成するかを記録します。
ITS2 陽性の各サンプルについて、残りの ITS2 PCR 産物をサンガーシーケンシングに使用し、シーケンシングプラットフォームから各 S-Label の seq 出力ファイルを取得します。ウェブブラウザでNBCI BLASTのウェブサイトに移動して、BLAST検索を開始します。Caenorhabditis種にBLASTするSプレート配列の場合、種ID列にBLASTがヒットした上位の属名と種名を入力します。
Caenorhabditis命名規則に従って、株に一意の名前を付け、株名列に株名を入力します。データを処理するには、フルクラム Web サイトに移動し、フルクラム データベースから生のプロジェクト データをエクスポートします。新しい R スクリプトを開き、イージーフルクラム ビネットの指示に従ってコレクション データを処理します。
NBCI BLASTでは、SレーベルS-05554の結果は、トップヒットがCaenorhabditisブリッグサエであることを示しています。さらに、いくつかの単離された線虫は、遺伝子型決定に追加の努力を必要とする。例えば、分離株の約 2% は、最初の溶解試行後に SSU PCR プライマーセットで増幅できず、溶解材料が ITS2 プライマーセットによる増幅に適していることを確認するために再依存する必要があります。
この手順に従って、研究者は野生の線虫分離株に関連する生態学的および環境的データを探索して、特定の線虫種を保有する可能性が最も高い場所および基質特性を特定することができる。
