2.2K Views
•
09:10 min
•
March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
Denne protokollen kan brukes til å effektivisere isolasjonen og identifiseringen av Caenorhabditis nematoder fra naturen og registrere viktige økologiske og miljømessige data knyttet til nematodenes naturlige miljø. De viktigste fordelene med denne teknikken er skalerbarheten og nøyaktigheten, som er mulig ved å utnytte mobile datainnsamlingsplattformer, skybaserte databaser og standardiserte databehandlingsfunksjoner. For å begynne med, identifiser et sted å undersøke Caenorhabditis nematoder.
For å opprette et Fulcrum-prosjekt, opprett en konto hos Fulcrum online ved hjelp av en gratis utdanningsavtale og legg til nematodefeltets prøvetakingssøknad. Legg deretter til nematodeisolasjonsapplikasjonen. Skriv ut et sett med QR-kodeetiketter som C-Etiketter for å spore samlingene og S-Labels for å spore nematodeisolasjonene.
Fest C-etikettene til Ziploc plastposer for pakking. Oppbevar settet med S-etiketter for bruk i laboratoriet. Velg nematodefeltprøvetakingen fra rullegardinmenyen i Fulcrum-mobilappen, og trykk pluss for å starte en ny post i prosjektet.
Ta et bilde av substratet. Trykk på C-Label-feltet og velg skanning. Skann strekkoden på oppsamlingsposen ved hjelp av kameraet på mobilenheten, og trykk deretter på Ferdig.
Trykk på substratfeltet og velg en substrattype. Mål overflatetemperaturen til substratet ved hjelp av det ikke-kontakttermometeret og registrer verdien i substrattemperaturfeltet. Mål og registrer også omgivelsestemperaturen og fuktigheten.
Lagre og ta opp i Fulcrum ved å trykke på lagre øverst til venstre på skjermen. Samle en spiseskje av substratet uten pinner eller andre harde stykker ved å invertere oppsamlingsposen som en hanske for å plukke opp substratet, og forsegle deretter posen. For hver Ziploc-pose noterer du C-etiketten på posen og fester en matchende C-Etikett til lokket på en 10 centimeter plate som er flekket med OP50-bakterier.
Overfør en spiseskje prøve fra hver oppsamlingspose til C-platene ved hjelp av en ren plastskje. På Fulcrum-applikasjonen velger du nematodeisolasjon fra applikasjonsmenyen. Lag deretter en ny isolasjonspost ved å trykke på plussikonet nederst til høyre.
Trykk på velg-knappen for å finne C-etiketten som er knyttet til et eksempel. Trykk på søkeikonet. Trykk deretter på skanneikonet for å skanne C-Label QR-koden.
Se etter nematoder på C-platen med et dissekerende mikroskop. Trykk på ormene på prøvefeltet for å registrere tilstedeværelsen av nematoder på prøven. Hvis det ikke finnes nematoder, parafilm C-platen og kast den i en biofarebeholder.
Hvis nematoder er til stede, isolere opptil fem nematoder fra C-platen og overføre hver til sin egen S-plate. Trykk deretter på S-merket platefelt for å gå inn i S-platen som brukes til denne isolasjonen. Trykk på pluss i nedre høyre.
Trykk på S-Label og klikk deretter på skann for å åpne enhetskameraet, og skann deretter S-Label QR-koden på S-platen. Trykk på lagre-knappen øverst til høyre når isolasjonsposten har all informasjon lagt til riktig, deretter parafilm the-S-platene med isolerte nematoder og sett dem til side i et område utpekt til å holde S-plater med nematoder. Logg på Fulcrum-nettstedet og velg nematodeisolasjonsapplikasjonen.
Klikk på eksportøren for å laste ned en zip-fil som inneholder nematodeisolasjonen s_labeled_plates. CSV-filen. Naviger til den ville isoler genotypingsmalen Google Sheet og kopier Google Sheet.
Plasser S-etikettene kopiert fra nematodeisolasjonen s_labeled_plates. csv-kolonnen inn i genotypingsarket. Se etter spredende dyr på S-plater 48 timer etter isolasjon.
Hvis en S-plate har proliferating dyr, skriv inn en i spredning 48 kolonnen i genotyping arket, og flytt deretter S-platen til en boks merket 48 timer spredningsboks en. Sjekk S-platene som ikke spredte seg etter 48 timer etter isolasjon igjen klokken 168 timer etter isolasjon. Hvis en S-plate nå sprer seg, skriver du inn en i spredningskolonnen 168 på genotypingsarket og flytter deretter S-platen til en boks merket 168 timer spredningsboks en.
Filtrer genotypen i Google Sheet for å inkludere bare S-etikettene i en spredningsboks som skal lyseres, og velg deretter kolonnene S-Label gjennom lysisnoder. Skriv ut et lysis-regneark for hver spredningsboks som skal lyseres. Forbered 12 brønnstrimmelrør for prøvene som skal lyseres.
Løsne ett striperør og tilsett åtte mikroliter lysisbuffer til hver hette med en gjentatt pipetter. Velg tre til fem dyr fra kildeplatene i hetteposisjonene som er angitt på lysis-regnearket. Gjenta for opptil åtte striperør og plasser striperørene i minus 80 grader Celsius fryser.
Fjern settene med striperør og kjør lysisprogrammet i termosykleren. Lagre deretter lysatene på minus 80 grader Celsius i opptil en uke. Fjern striperørene fra minus 80 grader Celsius fryseren og tine lysismaterialet på is.
Mens lysismaterialet tiner, forberede ITS2 og SSU master blander seg i separate rør på is. Tilsett to mikroliter lysat til riktig brønn i PCR-platen med en flerkanals pipette med lavt volum. Kjør PCR-ene med riktig termocycler-program og registrer hvilke S-Labels som gir ITS2- eller SSU PCR-produkter i genotypingsarket.
For hver prøve som er ITS2-positiv, bruk det gjenværende ITS2 PCR-produktet for Sanger-sekvensering og få seq-utdatafilene for hver S-Label fra sekvenseringsplattformen. Naviger til NBCI BLAST-nettstedet i en nettleser for å starte BLAST-søket. For S-platesekvenser som BLAST til en Caenorhabditis-art, skriv inn hele slekten og artsnavnet til den øverste BLAST-hiten i artens ID-kolonne.
Navngi stammene med unike navn, følg Caenorhabditis nomenklaturkonvensjoner og skriv inn belastningsnavnene i strekknavnkolonnen. For å behandle dataene, naviger til Fulcrum-nettstedet og eksporter råprosjektdataene fra Fulcrum-databasen. Åpne et nytt R-skript og følg instruksjonene i easyfulcrum-vignetten for å behandle innsamlingsdataene.
I NBCI BLAST viser resultatene for S-Label S-05554 at topphiten er Caenorhabditis briggsae. I tillegg krever noen isolerte nematoder ekstra innsats for å genotype. For eksempel klarer omtrent 2% av isolasjonene ikke å forsterke med SSU PCR primer satt etter det første lysisforsøket og må stoles på for å sikre at lysismaterialet er egnet for forsterkning med ITS2 primer-settet.
Etter denne prosedyren kan forskere utforske de økologiske og miljømessige dataene forbundet med ville nematodeisolasjoner for å identifisere steder og substrategenskaper som mest sannsynlig vil huse spesifikke nematodearter.
Denne protokollen kan brukes til å utføre store økologiske undersøkelser av selfing Caenorhabditis nematoder. Den viktigste fordelen med denne metoden er effektiv organisering og analyse av økologiske og molekylære data knyttet til nematodene samlet inn fra naturen.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved