2.2K Views
•
09:10 min
•
March 1st, 2022
DOI :
March 1st, 2022
•0:04
Introduction
0:34
Collection Preparation
1:21
Field Collection
2:21
Plating Out Field Collections and Isolating Nematodes from Collections
4:06
Exporting S-Plates from Fulcrum
4:41
Check for Proliferation on S-Plates
5:26
Lysis of Isofemale Lines
6:22
PCR of SSU and ITS2 Sequences
7:00
Identifying Nematodes and Processing the Collection Data
8:04
Results: Identifying Nematodes with Sanger Sequencing and Sequence BLAST
8:40
Conclusion
Transcript
Detta protokoll kan användas för att effektivisera isolering och identifiering av Caenorhabditis nematoder från naturen och registrera viktiga ekologiska och miljömässiga data i samband med nematodernas naturliga miljö. De främsta fördelarna med denna teknik är dess skalbarhet och noggrannhet, som möjliggörs genom att utnyttja mobila datainsamlingsplattformar, molnbaserade databaser och standardiserade databehandlingsfunktioner. Till att börja med, identifiera en plats för att undersöka Caenorhabditis nematoder.
För att skapa ett Fulcrum-projekt skapar du ett konto hos Fulcrum online med hjälp av ett utbildningsavtal utan kostnad och lägger till nematodfältprovtagningsapplikationen. Lägg sedan till nematodisoleringsapplikationen. Skriv ut en uppsättning QR-kodetiketter som C-etiketter för att spåra samlingarna och S-etiketterna för att spåra nematoderiisoleringarna.
Fäst C-etiketterna på Ziploc plastpåsar för förpackning. Förvara uppsättningen S-etiketter för användning i laboratoriet. Välj nematodfältsprovtagningen i den nedrullningsbara menyn i Fulcrum-mobilappen och tryck på plus för att starta en ny post i projektet.
Ta ett foto av substratet. Tryck på C-Label-fältet och välj skanna. Skanna streckkoden på insamlingspåsen med hjälp av den mobila enhetskameran och tryck sedan på klar.
Knacka på substratfältet och välj en substrattyp. Mät yttemperaturen på substratet med hjälp av beröringsfri termometer och registrera värdet i substratets temperaturfält. Mät och registrera även omgivningstemperaturen och luftfuktigheten.
Spara och spela in i Fulcrum genom att trycka på spara längst upp till vänster på skärmen. Samla en matsked av substratet utan pinnar eller andra hårda bitar genom att invertera uppsamlingspåsen som en handske för att plocka upp substratet och försegla sedan påsen. För varje Ziploc-påse, notera C-Etiketten på påsen och fäst en matchande C-Label på locket på en 10 centimeters tallrik som är fläckig med OP50-bakterier.
Överför en matsked prov från varje uppsamlingspåse till C-plattorna med en ren plastsked. I Fulcrum-programmet väljer du nematodisolering från programmenyn. Skapa sedan en ny isoleringspost genom att trycka på plusikonen längst ned till höger.
Tryck på select-knappen för att hitta den C-etikett som är associerad med ett exempel. Tryck på sökikonen. Tryck sedan på skanningsikonen för att skanna C-Label QR-koden.
Leta efter nematoder på C-plattan med ett dissekerande mikroskop. Tryck på maskarna på provfältet för att registrera närvaron av nematoder på provet. Om inga nematoder förekommer, parafilma C-plattan och kassera den i en biohazard bin.
Om nematoder förekommer, isolera upp till fem nematoder från C-plattan och överför var och en till sin egen S-platta. Tryck sedan på fältet S-märkta plattor för att ange den S-plattan som används för denna isolering. Tryck på pluset längst ner till höger.
Tryck på S-Label och klicka sedan på skanning för att öppna enhetskameran och skanna sedan S-Label QR-koden på S-plattan. Tryck på spara-knappen längst upp till höger när isoleringsposten har all information som lagts till korrekt, parafilma sedan S-plattorna med isolerade nematoder och lägg dem åt sidan i ett område som är avsett att hålla S-plattor med nematoder. Logga in på Fulcrums webbplats och välj nematodisoleringsapplikationen.
Klicka på exportören för att ladda ner en zip-fil som innehåller nematodisoleringen s_labeled_plates. csv-fil. Navigera till den vilda isolat genotypningsmallen Google Sheet och kopiera Google Sheet.
Placera S-etiketterna som kopierats från nematodenisoleringen s_labeled_plates. csv-kolumnen i genotypningsbladet. Kontrollera om det finns förökande djur på S-plattor 48 timmar efter isolering.
Om en S-platta har förökande djur anger du en i spridningskolonnen 48 i genotypningsplåten och flyttar sedan S-plattan till en låda märkt 48 timmar spridningsruta ett. Kontrollera S-plattorna som inte spred sig vid 48 timmar efter isolering igen vid 168 timmar efter isolering. Om en S-platta nu förökar sig anger du en kolumn i spridning 168 på genotypningsplåten och flyttar sedan S-plattan till en ruta märkt 168 timmar spridningsruta ett.
Filtrera genotypen i Google Sheet så att den bara innehåller S-etiketterna i en spridningsruta som ska lysas och välj sedan kolumnerna S-Label via lysnoder. Skriv ut ett lyskalkylblad för varje spridningsruta som ska lysas. Förbered 12 brunnsrör för att proverna skalysas.
Lossa ett bandrör och tillsätt åtta mikroliter lysbuffert till varje lock med en upprepad pipa. Plocka tre till fem djur från källplattorna i de kapsylpositioner som anges i lyskalkylbladet. Upprepa i upp till åtta bandrör och placera bandrören i minus 80 grader Celsius frys.
Ta bort uppsättningarna av bandrör och kör lysprogrammet i termocykeln. Förvara sedan lysatesna på minus 80 grader Celsius i upp till en vecka. Ta bort bandrören från minus 80 grader Celsius frys och tina lysmaterialet på is.
Medan lysmaterialet tinar, förbered ITS2 och SSU masterblandningar i separata rör på is. Tillsätt två mikroliter lysat till lämplig brunn i PCR-plattan med en lågvolyms flerkanalig pipett. Kör PCR med lämpligt termocykelprogram och registrera vilka S-Etiketter som ger ITS2- eller SSU PCR-produkter i genotypningsbladet.
För varje prov som är ITS2-positivt använder du den återstående ITS2 PCR-produkten för Sanger-sekvensering och hämtar sekvenseringsfilerna för varje S-Etikett från sekvenseringsplattformen. Navigera till NBCI BLAST-webbplatsen i en webbläsare för att börja BLAST-sökningen. För S-pläterar ordnar det BLAST till en Caenorhabditis art, ange det fulla släktet och artnamnet av den bästa BLAST-hiten i art-ID-kolonnen.
Namnge stammarna med unika namn, följ Caenorhabditis nomenklaturkonventioner och ange stamnamnen i stamnamnskolumnen. Om du vill bearbeta data navigerar du till Fulcrums webbplats och exporterar rådata från Fulcrum-databasen. Öppna ett nytt R-skript och följ anvisningarna i easyfulcrum-vinjetten för att bearbeta insamlingsdata.
I NBCI BLAST visar resultaten för S-Label S-05554 att den bästa träffen är Caenorhabditis briggsae. Dessutom kräver vissa isolerade nematoder ytterligare ansträngning för att genotyp. Till exempel misslyckas cirka 2 % av isolaten med SSU PCR-primern efter det första lysförsöket och måste förlita sig på att lysmaterialet är lämpligt för förstärkning med ITS2-primeruppsättningen.
Efter denna procedur kan forskare utforska de ekologiska och miljömässiga data som är associerade med vilda nematodisolat för att identifiera platser och substrategenskaper som mest sannolikt hyser specifika nematoderter.
Detta protokoll kan användas för att utföra storskaliga ekologiska undersökningar av självgående Caenorhabditis nematoder. Den främsta fördelen med denna metod är effektiv organisation och analys av ekologiska och molekylära data associerade med nematoder som samlas in från naturen.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved