Name: isolation and characterization of the immune cells from micro-dissected mouse choroid plexuses
Uploaded: 2022-02-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses at JoVE.com

Institut Pasteur Animalerie Centrale과 CB-UTechS 시설 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작업은 파스퇴르 연구소에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

모든 절차는 실험실 동물 취급에 대한 유럽 집행위원회의 지침, 지침 86/609/EEC에 동의했습니다. 그들은 윤리위원회 번호 59, CETEA/CEEA No. 089, dap210067 및 APAFIS #32382-2021070917055505 v1의 승인을 받았습니다.
1. 물질의 제조
<ol><li>모든 항체 (물질 표)를 4°C에서 저장하고, 광 노출로부터 보호한다.</li>
	<li>DAPI 원액 (1 mg/mL): 분말을 PBS-/- (표 물질), 분...

<ol>
	<li>Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota-brain+axis+in+behaviour+and+brain+disorders.">The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).</li><li>Deczkowska, A., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuro-immune+communication+in+neurodegeneration:+Challenges+and+opportunities.">Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).</li><li>Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+compartmentalization+for+brain+surveillance+and+protection.">Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection.</a> Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).</li><li>Erny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+microbiota+constantly+control+maturation+and+function+of+microglia+in+the+CNS.">Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).</li><li>Mrdjen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+single-cell+mapping+of+central+nervous+system+immune+cells+reveals+distinct+myeloid+subsets+in+health,+aging,+and+disease.">High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease.</a> Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).</li><li>Korin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=single-cell+characterization+of+the+brain's+immune+compartment.">single-cell characterization of the brain's immune compartment.</a> Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).</li><li>van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models.">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).</li><li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus:+Biology+and+pathology.">Choroid plexus: Biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Falc&#227;o, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone:+Go+with+the+flow.">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Mazucanti, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+insulin+produced+by+the+choroids+plexis+is+regulated+by+serotonergic+signaling.">Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling.</a> JCI Insight. 4 (23), (2019).</li><li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function.">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li><li>Deczkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mef2C+restrains+microglial+inflammatory+response+and+is+lost+in+brain+ageing+in+an+IFN-I-dependent+manner.">Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells.">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li><li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury.">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li><li>Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system:+From+development+to+aging.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging.</a> Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).</li><li>da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer's+disease.">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li><li>Schwarze, E. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+(Kolmer's)+epiplexus+cells.">The origin of (Kolmer's) epiplexus cells.</a> Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).</li><li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-specific+immunity+at+the+choroid+plexus+shifts+toward+destructive+Th2+inflammation+in+brain+aging.">CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).</li><li>Kunis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-&#947;-dependent+activation+of+the+brain's+choroid+plexus+for+CNS+immune+surveillance+and+repair.">IFN-&#947;-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair.</a> Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+From+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fate+and+dynamics+of+macrophages+at+central+nervous+system+interfaces.">fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces.</a> Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).</li><li>Fung, I. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+group+2+innate+lymphoid+cells+alleviates+aging-associated+cognitive+decline.">Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).</li><li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress.">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5, 4111 (2019).</li><li>Shechter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+beneficial+M2+macrophages+to+injured+spinal+cord+is+orchestrated+by+remote+brain+choroid+plexus.">Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus.</a> Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).</li><li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+brain+and+choroid+plexus+cell+types+in+severe+COVID-19.">Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19.</a> Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).</li><li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immune+checkpoint+blockade+reduces+pathology+and+improves+memory+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).</li><li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+immune+tolerance+by+targeting+Foxp3++regulatory+T+cells+mitigates+Alzheimer's+disease+pathology.">Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology.</a> Nature Communications. 6, 7967 (2015).</li><li>Rodr&#237;guez-Rodr&#237;guez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crisp&#237;n, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-&#945;/&#946;+CD4+&#8722;+CD8+&#8722;+double+negative+T+cells+arise+from+CD8+++T+cells.">TCR-&#945;/&#946; CD4 &#8722; CD8 &#8722; double negative T cells arise from CD8 + T cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).</li><li>Schafflick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+CNS+border+compartment+leukocytes+reveals+that+B+cells+and+their+progenitors+reside+in+non-diseased+meninges.">Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges.</a> Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).</li><li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNGR-1++dendritic+cells+are+located+in+meningeal+membrane+and+choroid+plexus+of+the+noninjured+brain.">DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain.</a> GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).</li><li>Kabashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+evaluation+of+mast+cell+and+basophil+activation.">Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation.</a> Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).</li><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Immune+and+non-immune+functions.">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li></ol>

뇌 항상성 및 질병에 대한 면역학적 기여를 이해하려는 연구는 주로 뇌 실질 내에 존재하는 세포에 초점을 맞추었고, 그럼에도 불구하고 뇌 기능에 중요한 기여자인 CP와 같은 뇌 경계를 무시했다2,3. CP에서 면역 세포 집단의 분석은 CP의 크기가 작고, 상주 면역 세포의 수가 적으며,이 조직에 대한 복잡한 접근으로 인해 어렵습니다. 총 뇌 면역 세포 (CD45<...

19 세기 후반 Paul Erhlich가 혈액 - 뇌 장벽을 발견 한 이래로 뇌는 다른 장기 및 혈류와 사실상 분리 된 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 지난 10 년 동안 뇌 기능은 장내 미생물 및 전신 면역 세포 및 신호와 같은 다양한 생물학적 요인에 의해 형성된다는 개념의 출현을 보았습니다1,2,3,4. 동시에, 수막과 맥락막 신경총(CP)과 같은 다른 뇌 경계는 불활성 장벽 조직보다는 활성 면역-뇌 교차 대화의 계면으로 확인되었다5,6,7,8.
CP는 뇌와 주변을 분리하는 경계 중 하나 인 혈액 뇌척수액 장벽을 구성합니다. 그들은 뇌의 네 개의 심실, 즉 세 번째, 네 번째 및 양쪽 측심실 각각에 위치하고 있으며 해마의 심실 하부 영역 및 세분화 된 영역과 같은 신경 발생과 관련된 영역에 인접 해 있습니다3. 구조적으로, CP는 상피 세포의 단층으로 둘러싸인 연합 된 혈액 모세 혈관의 네트워크로 구성되며, 이들은 단단하고 부착 된 접합부에 의해 상호 연결되어 있습니다9,10. CP 상피의 주요 생리적 역할은 폐대사산물 및 단백질 응집체로부터 뇌를 세척하는 뇌척수액의 생산과 호르몬 및 신경영양 인자를 포함한 다양한 신호전달 분자의 생산 및 제어된 혈액-뇌 통과를 포함한다11,12,13. CP로부터 분비된 분자는 뇌의 활동, 즉 신경발생과 미세아교세포기능14,15,16,17,18,19을 조절함으로써 뇌의 활동을 형성하며, 이는 CP를 뇌 항상성에 결정적으로 만든다. CP는 또한 다양한 면역 활동에 관여합니다. 비병리학적 조건 하에서 뇌 실질의 주요 면역 세포 유형은 미세아교세포인 반면, CP 면역 세포 집단의 다양성은 말초 기관3,7에서와 같이 광범위하며, 이는 다양한 면역 조절 및 신호전달 채널이 CP에서 작용하고 있음을 시사한다.
내피 세포와 상피 세포 사이의 공간인 CP 스트로마는 주로 염증 신호에 반응하여 전염증성 사이토카인 및 항원 제시와 관련된 분자를 발현하는 경계-관련 대식세포(BAM)에 의해 채워진다3. 대식세포의 또 다른 아형인 콜머의 상복부 세포는 CP 상피20의 정점 표면에 존재한다. CP stroma는 또한 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 선천성 림프계 세포 및 중추 신경계 항원을 인식 할 수있는 대부분 이펙터 기억 T 세포 인 T 세포의 틈새 시장입니다7,21,22,23,24. 또한, CP에서의 면역 세포 집단의 조성물 및 활성은 전신 또는 뇌 교란시, 예를 들어, 노화 동안10,14,15,21,25, 미생물 교란7, 스트레스26, 및 질병27,28 동안 변화한다. 주목할 만하게, 이러한 변화는 간접적으로 뇌 기능, 즉 뇌 노화에서 발생하는 Th2 염증으로의 CP CD4+ T 세포의 이동이 제안되었고, 노화와 관련된 인지 저하를 형성할 수 있는 CP로부터의 면역 신호전달을 촉발시킨다14,15,21,25,29 . 따라서 CP 면역 세포의 특성을 조명하는 것은 CP 상피 생리학 및 분비에 대한 조절 기능을 더 잘 이해하고 건강 및 질병 조건에서 뇌 기능에 대한 간접적 인 영향을 해독하는 데 중요합니다.
CP는 단지 몇 개의 면역 세포만을 포함하는 작은 구조이다. 그들의 분리는 관류의 예비 단계 후에 미세 해부를 필요로한다; 혈류의 면역 세포는 그렇지 않으면 주요 오염 물질을 구성 할 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석기를 사용하여 CP의 골수성 및 T 세포 서브세트를 특성화하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 비염증성 조건 하에서 마우스 CP를 구성하는 면역 세포 집단의 약 90%를 확인하는데, 이는 면역 CP 이질성을 해부하기 위한 다른 방법을 사용하는 최근 발표된 연구에 따른다7,10,28. 이 프로토콜은 생체내에서 질병 및 다른 실험적 패러다임과 함께 CP 면역 세포 구획의 변화를 특성화하는데 적용될 수 있었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, bovine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CX3CR1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>149008</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse TCRb</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 anti-mouse CD4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100414</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 anti-mouse IA-IE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>107628</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5 Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 anti-mouse Ly6C</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128037</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>Enzyme to dissociate CP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Live/dead marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ion chelator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller infusion inset</td>
			<td>CareFusion</td>
			<td>RG-3-C</td>
			<td>Blood perfusion inset</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine, anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td>Control beads to realize compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS+/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100708</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123110</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101256</td>
			<td>Flow cytometry antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Xylazine, anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thin forceps</td>
			<td>Dumoxel Biology</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetergesic</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Buprenorphin, analgesic</td>
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isolation and characterization of the immune cells from micro-dissected mouse choroid plexuses

뇌는 더 이상 고립되어 기능하는 기관으로 간주되지 않습니다. 축적 된 증거는 말초 면역 체계의 변화가 간접적으로 뇌 기능을 형성 할 수 있음을 시사합니다. 뇌와 전신 순환 사이의 계면에서, 혈액 뇌척수액 장벽을 구성하는 맥락막 신경총(CP)은 주변부와 뇌 간 통신의 핵심 부위로 강조되고 있다. CP는 뇌척수액, 신경 영양 인자 및 뇌 항상성을 형성 할 수있는 신호 전달 분자를 생산합니다. CP는 또한 활성 면역 학적 틈새 시장입니다. 생리적 조건 하에서 주로 미세아교세포에 의해 채워지는 뇌 실질과는 달리, CP 면역 세포의 이질성은 다른 말초 기관에서 발견되는 다양성을 되풀이한다. CP 면역 세포 다양성 및 활성은 노화, 스트레스 및 질병에 따라 변화하고 CP 상피의 활성을 조절하여 간접적으로 뇌 기능을 형성합니다. 이 프로토콜의 목표는 뮤린 CP를 분리하고 그들을 채우는 주요 면역 서브 세트의 약 90 %를 확인하는 것입니다. 이 방법은 CP 면역 세포를 특성화하고 주변부와 뇌 간 의사 소통을 조율하는 기능을 이해하는 도구입니다. 제안 된 프로토콜은 CP 면역 세포가 건강 및 다양한 질병 조건에서 간접적으로 뇌 기능을 조절하는 방법을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에 제시된 유세포 분석 결과 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합 (각각 그림 1 및 그림 2)과 고도로 재현 가능한 방식으로 마우스 당 상대적 총 수가 성공적으로 밝혀졌습니다 (그림 3).
골수성 세포의 유세포 분석 결과, CP는 CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM에 의해 채워져 CP에서 CD45+ ?...

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Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...

이 프로토콜은 마우스 모델에서 다양한 맥락에서 뇌의 조절에서 맥락막 신경총과 말초 면역 세포의 역할에 관한 질문을 해결하는데 유용할 수 있다. 이 프로토콜은 마우스의 맥락막 신경총에서 독특한 면역 세포 집단에 대한 심층적 인 정량적 및 질적 분석을 가능하게합니다. 맥락막 신경총의 해부는 작은 크기와 투명한 색상으로 인해 처음에는 어려울 수 있습니다.먼저 관류되지 않은 동물에 대해 연습하는 것이 좋습니다. 시작하려면 C57 검은 여섯 마리의 마우스 등쪽에서 해부 된 뇌를 페트리 접시에 올려 놓고 접시를 쌍안 루프의 목표 아래에 놓습니다. 포셉을 사용하여 뇌를 제자리에 유지하면서 반구 사이의 중간 선을 통해 다른 한 쌍의 포셉의 두 끝을 삽입하십시오.포셉을 사용하여 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 당겨 측심실과 세 번째 심실의 일부를 노출시킵니다. 측면 맥락막 신경총을 측면 심실을 감싸고 양쪽 끝에서 불타는 긴 베일로 확인하십시오. 그런 다음 얇은 집게의 두 끝을 사용하여 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오.해마의 후부 주름에 의해 숨겨진 삼각형 후부 부분을 수집하도록주의하십시오. 다음으로, 대측 반구의 코퍼스 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 세 번째 심실 전체와 반대쪽 측심실을 노출시킵니다. 미세한 포셉을 사용하여 세분화 된 표면 측면을 가진 짧은 구조로 확인 된 세 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오.그런 다음 다른 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오. 다음으로, 소뇌와 중뇌 사이에 포셉의 두 끝을 삽입하고 소뇌와 수질에서 소뇌를 분리하여 네 번째 심실을 노출시킵니다. 그런 다음 네 번째 맥락막 신경총을 측면 오른쪽 끝에서 소뇌와 수질 사이의 왼쪽 끝으로 네 번째 심실을 정렬하는 세분화 된 표면 측면이있는 긴 구상 구조로 확인하십시오.미세한 포셉을 사용하여 네 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오. 수집된 모든 맥락막 신경총을 콜라게나제 IV로 인큐베이션한 후, 약 10회 정도 위아래로 부드럽게 피펫을 올려 해리를 마무리한다. 그런 다음 튜브를 MACS 버퍼로 1.5 밀리리터로 채워 콜라게나제 IV 활성을 정지시킨다.다음으로, 세포를 원심분리하고, 세포를 1.5 밀리리터의 MACS 완충액으로 세척하기 전에 상층액을 버린다. 적절한 보상 비드 및 항체 용액을 첨가한 후, 샘플을 30 내지 45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여, 광 노출로부터 보호한다. 그런 다음 튜브를 1.5 밀리리터의 MACS 버퍼로 채우고 세포 및 보상 비드를 원심분리합니다.세포 및 보상 비드를 500 마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁시킨 후, 세포를 70 미크론 스트레이너를 통해 여과한다. 유세포 분석기와 소프트웨어를 켠 후 크기에 따라 세포의 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 및 게이트를 선택합니다. 그런 다음 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이가있는 단일 셀에 대한 딸 게이트를 만듭니다.다음으로, DAPI 양성 세포를 제외하기 위해 DAPI 대 순방향 산란 영역을 갖는 살아있는 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 그런 다음 CD45 대 전방 산란 영역을 가진 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 이제 CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 만들고 F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 양성 F480 양성 및 CD11b 양성 F480 음성 집단을 확인합니다.그런 다음 CD11b 양성 F480 양성 세포에 대한 딸 게이트를 만들고 CX3CR1 대 IA-IE를 선택하여 CX3CR1 양성 IA-IE 양성 경계 관련 대식세포와 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포를 모두 확인합니다. 다음으로, CD11b 양성 F480 양성 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포에 대한 딸 게이트를 만들고, F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 콜머의 에피플렉서스 대식세포 및 CD11b 양성 F480 고 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 경계 관련 대식세포 둘 다를 확인한다. 그런 다음 CD11b 양성 F480 음성 집단으로부터, Ly6C 대 IA-IE에 대한 게이트.IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단과 주로 단핵구 또는 호중구에 해당하는 IA-IE 음성 Ly6C 양성 세포를 모두 선택하십시오. 마지막으로, CD11b 양성 F480 음성 IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD11b 대 CX3CR1을 선택합니다. 그런 다음 CD11b 높은 CX3CR1 저와 CD11b 양성 CX3CR1 음성 집단 모두를 확인한다.T 세포 게이팅의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 DAPI 양성 세포를 배제한 후, CD45 대 FSC-A를 갖는 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성한 다음, CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 생성하고 TCR 베타 대 CD11b를 선택한다. CD11b 양성 골수성 세포를 배제하고 TCR 양성 CD11b 음성 T 세포 집단을 선택한다. 마지막으로, TCR 베타 양성 CD11b 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD4 대 CD8a를 선택하십시오.CD8 음성 및 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포 둘 다를 확인한다. 여기에서 입증 된 유세포 분석 결과는 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합과 마우스 당 상대적 총 수를 매우 재현 가능한 방식으로 성공적으로 밝혀 냈습니다. 골수성 세포의 유세포 분석 결과, 맥락막 신경총은 CD11b 양성 CX3CR1 양성 F480 고경계 관련 대식세포에 의해 채워지며, 맥락막 신경총에서 CD45 양성 면역 세포의 80%를 나타낸다는 것을 보여준다.콜머 상피 대식세포의 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 집단이 또한 확인되었다. CD11b 양성 F480 음성 면역 세포 중에서, Ly6C 음성 IA-IE 양성 세포의 두 개의 상이한 집단이 수지상 세포에 상응할 가능성이 있는 특징이 있었다. T-세포의 분석 및 게이팅 전략은 CD45 양성 CD11b 음성 TCR 베타 양성 세포의 소수 집단의 존재를 강조했다.그 중에서도, 마우스 당 약 30-50개의 CD8 음성 CD4 양성 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포는 생리학적 조건 하에서 맥락막 신경총을 채웠다. 모든 혈액 오염이 맥락막 신경총의 면역 성분을 흐리게 할 수 있기 때문에 관류의 품질을 조절하는 것이 중요합니다. 이 방법은 벌크 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 추가 분석을 위해 선택된 세포 집단의 분류에 뒤따를 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...