Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

تم دعم هذا البحث من خلال منحة من مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) إلى S.K.S. و N.Q.

ملاحظة: تم الحصول على البروتينات المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة، Hsp90 و Cdc37، تجاريا (انظر جدول المواد).
1. تنشيط الشريحة
ملاحظة: يتم سرد جميع المواد التي سيتم استخدامها في التجربة في جدول المواد. قم بتصفية جميع المحاليل المحضرة من خل...

في هذه الدراسة ، تم تقييم جدوى استخدام تقنية FEB (نهج توصيف حركي في الوقت الفعلي) لتحديد التفاعل الجزيئي الحيوي بين Hsp90 و Cdc37. اقترحت التجربة الاستكشافية الأولية (التجربة الأولى) أن اختيار تركيزات التحليل المناسبة هو جزء حاسم من التجربة وأنه ينبغي تصميم التجربة من خلال تضمين نقاط تركيز أعلى و...

التفاعلات الجزيئية الحيوية: البروتينات هي أجزاء أساسية من الكائنات الحية وتشارك في العديد من المسارات الجزيئية مثل استقلاب الخلية ، وبنية الخلية ، وإشارات الخلية ، والاستجابات المناعية ، والتصاق الخلايا ، وأكثر من ذلك. في حين أن بعض البروتينات تؤدي وظيفتها (وظائفها) بشكل مستقل ، فإن معظم البروتينات تتفاعل مع البروتينات الأخرى باستخدام واجهة ملزمة لتنسيق النشاط البيولوجي السليم1.
يمكن تصنيف التفاعلات الجزيئية الحيوية بشكل أساسي بناء على الخصائص الهيكلية والوظيفية المميزة للبروتينات المعنية2 ، على سبيل المثال ، بناء على أسطح البروتين أو الاستقرار المعقد أو استمرار التفاعلات3. يعد تحديد البروتينات الأساسية وأدوارها في التفاعلات الجزيئية الحيوية أمرا حيويا لفهم الآليات الكيميائية الحيوية على المستوى الجزيئي4. حاليا ، هناك طرق مختلفة للكشف عن هذه التفاعلات5: في المختبر6 ، في سيليكو7 ، في الخلايا الحية8 ، خارج الجسم الحي 9 ، وفي الجسم الحي10 مع كل منها نقاط القوة والضعف الخاصة بها. 
يتم إجراء الفحوصات في الجسم الحي باستخدام الحيوان بأكمله كأداة تجريبية11 ، ويتم إجراء الفحوصاتخارج الجسم الحي على مستخلصات الأنسجة أو الأعضاء بأكملها (مثل القلب والدماغ والكبد) في بيئة خارجية خاضعة للرقابة من خلال توفير الحد الأدنى من التغييرات في الظروف الطبيعية. التطبيق الأكثر شيوعا للدراسات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي هو تقييم الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية وآثار السمية للعوامل الدوائية المحتملة قبل التجارب البشرية من خلال ضمان سلامتها وفعاليتها بشكل عام12.
يمكن أيضا اكتشاف التفاعلات الجزيئية الحيوية داخل الخلايا الحية. يسمح لنا تصوير الخلايا الحية بمراقبة التفاعلات الديناميكية أثناء تنفيذها لتفاعلات مسار كيميائي حيوي معين13. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر تقنيات الكشف ، مثل التلألؤ الحيوي أو نقل طاقة الرنين الفلوري ، معلومات حول مكان وزمان حدوث هذه التفاعلات داخل الخلية14. على الرغم من أن الكشف في الخلايا الحية يقدم تفاصيل حاسمة ، إلا أن منهجيات الكشف هذه تعتمد على البصريات والتسميات ، والتي قد لا تعكس البيولوجيا الأصلية. كما أنها أقل تحكما من الطرق المخبرية وتتطلب خبرة متخصصة لأداء15.
تستخدم الطرق الحسابية في سيليكو في المقام الأول للفحص على نطاق واسع للجزيئات المستهدفة قبل التجارب في المختبر . طرق التنبؤ الحسابي ، وقواعد البيانات القائمة على الكمبيوتر ، والالتحام الجزيئي ، والعلاقات بين البنية الكمية والنشاط ، وغيرها من أساليب محاكاة الديناميكا الجزيئية هي من بين الراسخة في أدوات silico 16. بالمقارنة مع التقنيات التجريبية الشاقة ، يمكن لأدوات silico بسهولة إجراء تنبؤات بحساسية عالية ، ولكن مع دقة منخفضة في الأداء التنبؤي17.
يتم إجراء الفحوصات في المختبر مع الكائنات الحية الدقيقة أو الجزيئات البيولوجية خارج سياقها البيولوجي القياسي. يعد تصوير التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال الطرق المخبرية أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائف البروتين والبيولوجيا الكامنة وراء الشبكة المعقدة لعمل الخلايا. يتم اختيار منهجية الفحص المفضلة وفقا للخصائص الجوهرية للبروتين والقيم الحركية وطريقة وشدة التفاعلات18,19.
تفاعل Hsp90/Cdc37: يعد مسار المرافق-كيناز ، الذي يربط بين Hsp90 و Cdc37 ، هدفا علاجيا واعدا في بيولوجيا الورم20. يلعب Hsp90 دورا مركزيا في التحكم في دورة الخلية ، وتجميع البروتين ، وبقاء الخلية ، ومسارات الإشارات. يتم تسليم البروتينات التي تعتمد على Hsp90 لوظائفها إلى Hsp90 للتعقيد من خلال مرافق مشارك ، مثل Cdc37. يتحكم مركب Hsp90 / Cdc37 في طي معظم كينازات البروتين ويعمل كمركز للعديد من شبكات الإشارات داخل الخلايا21. وهو هدف واعد مضاد للورم بسبب تعبيره المرتفع في الأورام الخبيثة المختلفة ، بما في ذلك سرطان الدم النقوي الحاد ، والورم النقوي المتعدد ، وسرطان الخلايا الكبدية22,23.
يشيع استخدامها في تقنيات الكشف عن التفاعل الجزيئي الحيوي في المختبر الترسيب المناعي المشترك (co-IP) هو تقنية تعتمد على خصوصية الأجسام المضادة المستضدية لتحديد التفاعلات ذات الصلة بيولوجيا24. العيب الأساسي لهذه الطريقة هو عدم قدرتها على اكتشاف التفاعلات منخفضة التقارب والقيم الحركية24. ويفضل اتباع طرق فيزيائية حيوية مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، ورنين البلازمون السطحي (SPR)، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI)، وتكنولوجيا FEB لتحديد القيم الحركية.
ITC هي طريقة للكشف البيوفيزيائي تعتمد على تحديد طاقة الربط جنبا إلى جنب مع تحليل الديناميكا الحرارية الكامل لتوصيف التفاعلات الجزيئية الحيوية25. الميزة الأساسية ل ITC هي أنه لا يتطلب أي وضع علامات أو تثبيت للبروتين المستهدف. الصعوبات الرئيسية التي يواجهها مركز التجارة الدولية هي التركيز العالي للبروتين المستهدف المطلوب لتجربة واحدة وصعوبة تحليل المجمعات غير التساهمية بسبب المحتوى الحراري الصغير المرتبط26. كل من SPR و BLI هما تقنيتان بيوفيزيائيتان خاليتان من الملصقات تعتمدان على تجميد الجزيء المستهدف على سطح المستشعر ، تليها حقن لاحقة للتحليل فوق الهدفالمعطل 27,28. في SPR ، يتم قياس التغيرات في معامل الانكسار أثناء التفاعلات الجزيئية الحيوية27 ؛ في BLI، يتم تسجيل التداخل في الضوء المنعكس في الوقت الحقيقي كتغيير في الطول الموجي كدالة للوقت28. يشترك كل من SPR و BLI في مزايا مشتركة تتمثل في تقديم قدرات عالية من حيث الخصوصية والحساسية والكشف29. في كلتا الطريقتين ، يتم تجميد البروتين المستهدف على أسطح أجهزة الاستشعار الحيوية ، وبالتالي ، قد يكون هناك بعض الفقدان للتشكيل الأصلي للهدف ، مما يجعل من الصعب التمييز بين التفاعلات المحددة مقابل التفاعلات غير المحددة30. يستخدم BLI أجهزة استشعار حيوية باهظة الثمن من الألياف البصرية يمكن التخلص منها لشل حركة الهدف ، وبالتالي فهي تقنية مكلفة31. بالمقارنة مع أدوات الكشف الجزيئي الحيوي الراسخة هذه ، توفر تقنية FEB منصة موثوقة وخالية من الملصقات باستخدام تركيزات نانومولية منخفضة للكشف عن الجزيئات الحيوية في الوقت الفعلي مع التوصيف الحركي. تتغلب تقنية FEB أيضا على التحديات الفقاعية التي تواجهها ITC وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة ب SPR أو BLI.
تعد المستشعرات الحيوية القائمة على الترانزستور ذو التأثير الميداني (FET) مجالا ناشئا للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال تقديم تطبيقات طبية حيوية متنوعة. في نظام FET ، يتم تجميد الأهداف إلى رقائق الاستشعار الحيوي ويتم الكشف عن التفاعلات من خلال التغييرات في التوصيل32. الميزة الفريدة التي يجب مراعاتها في تطوير مستشعر حيوي إلكتروني فعال هي الخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل الطبيعة شبه الموصلة والاستقرار الكيميائي لمواد الطلاء المستخدمة في تصنيع سطح المستشعر33. المواد التقليدية مثل السيليكون المستخدمة في FET حدت من حساسية أجهزة الاستشعار لأنها تتطلب طبقات أكسيد محصورة بين قناة الترانزستور وبيئة محددة للعمل السليم34. علاوة على ذلك ، فإن ترانزستورات السيليكون حساسة للبيئات عالية الملح ، مما يجعل من الصعب قياس التفاعلات البيولوجية في بيئتها الطبيعية. يتم تقديم المستشعر الحيوي القائم على الجرافين كبديل لأنه يوفر استقرارا كيميائيا ممتازا ومجالا كهربائيا. نظرا لأن الجرافين عبارة عن طبقة ذرية واحدة من الكربون ، فهو حساس للغاية كأشباه موصلات ومتوافق كيميائيا مع المحاليل البيولوجية. كل من هذه الصفات مرغوب فيها لإنشاء أجهزة استشعار حيوية إلكترونية متوافقة35. تؤدي إمكانات التحميل العالية للغاية للجزيئات الحيوية التي توفرها أجهزة الاستشعار الحيوية المغلفة بالجرافين إلى تطوير تقنية FEB لأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الجرافين.
مبدأ تقنية FEB: FEB هي تقنية للكشف الجزيئي الحيوي خالية من الملصقات تقيس التيار الكهربائي من خلال مستشعر الجرافين الحيوي الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تؤدي التفاعلات بين البروتين المثبت والتحليل إلى تغيرات في التيار يتم رصدها في الوقت الفعلي ، مما يتيح قياسات حركية دقيقة36.
الأجهزة: يتكون نظام FEB من شريحة مستشعر الترانزستور ذات التأثير الميداني للجرافين (gFET) وقارئ إلكتروني يطبق جهدا ثابتا طوال التجربة (الشكل 1). يتم تطبيق التحليل في محلول على البروتين المستهدف المثبت على سطح المستشعر الحيوي. عند حدوث تفاعل ، يتم قياس تغيير في التيار وتسجيله في الوقت الفعلي. مع زيادة تركيز التحليل ، سيزداد أيضا جزء التحليل المرتبط ، مما يتسبب في حدوث تناوب أعلى في التيار. باستخدام برنامج التحليل الآلي المزود بالأداة (جدول المواد) ، يتم قياس I-Response وتسجيله من حيث وحدات الاستشعار البيولوجي (BU)37. يتم تعريف I-Response على أنه التغيير في التيار (I) من خلال شريحة المستشعر الحيوي التي يتم قياسها في الوقت الفعلي عند تفاعل الهدف المثبت مع التحليل. يمكن لبرنامج التحليل الآلي FEB تحليل كل من I-Response و C-Response لأحداث التفاعل الديناميكي ، حيث يسجل C-Response التغييرات في السعة (C). تتوافق الاختلافات في كل من I-Response و C-Response مباشرة مع جزء التحليل المرتبط ويمكن تحليلها بشكل أكبرلإنشاء قيم K D. التفضيل الافتراضي لبرنامج التحليل الآلي هو I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على الإعداد التجريبي . (أ) رقاقة قائمة على الجرافين وقارئ إلكتروني. (ب) نظرة عامة على مكونات الشريحة. يتم توصيل الشريحة بقطبين كهربائيين يزودان النظام بالتيار الكهربائي. سطح الشريحة مغطى بالجرافين ، والذي عند تنشيطه يمكن أن يربط الهدف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
منهج: في البداية ، يتم إدخال شريحة المستشعر الحيوي المنشطة في جهاز FEB (الشكل 1) متبوعا بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه: (1) المعايرة: تبدأ التجربة بمعايرة النظام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4) لإنشاء استجابة توازن خط الأساس. (2) الاقتران: يتم إدخال التحليل في الشريحة ، ويتم مراقبة I-Response حتى يتم الوصول إلى تشبع الربط. (3) الانفصال: يتم فصل التحليل باستخدام 1x PBS. (4) التجديد: تتم إزالة بقايا التحليل باستخدام 1x PBS. (5) الغسيل: يتم إجراء ما مجموعه خمس غسلات باستخدام 1x PBS لإزالة التحليلات المربوطة وغير المربوطة من الشريحة بشكل شامل.
تحليل: يتم إجراء تحليل البيانات باستخدام البرنامج الآلي بالكامل المقدم مع الأداة. يقوم برنامج التحليل الآلي بإنشاء قطعة أرض مناسبة لHill بقيمة K D. تصف مؤامرة هيل فيت ارتباط التحليل بالبروتين المستهدف كدالة لتركيزات التحليل. يتناسب التركيز الذي يتم فيه تحقيق استجابة نصف قصوىمع قيمة K D. تمثل قيمة KD المنخفضة تقاربا عاليا للربط والعكس صحيح.
للتحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها من تجربة FEB ، يتم استخراج I-Responses من كل نقطة قراءة لكل تركيز تحليلي باستخدام برنامج مراجعة / تصدير البيانات ويمكن تصديرها إلى برامج التحليل الإحصائي الأخرى (انظر جدول المواد) كما هو موضح أدناه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

تلعب التفاعلات الجزيئية الحيوية أدوارا متعددة الاستخدامات في العديد من العمليات الخلوية من خلال تنظيم وتنسيق الأحداث البيولوجية ذات الصلة وظيفيا. الجزيئات الحيوية مثل البروتينات والكربوهيدرات والفيتامينات والأحماض الدهنية والأحماض النووية والإنزيمات هي لبنات أساسية للكائنات الحية. يتجمعون في شبكات معقدة في الأنظمة الحيوية لمزامنة عدد لا يحصى من أحداث الحياة. تستخدم البروتينات عادة شبكات تفاعلية معقدة للقيام بوظائفها. وبالتالي ، من الضروري تقييم مثل هذه التفاعلات للكشف عن أهميتها في الخلايا على المستويين الخلوي والكائنات الحية. ولتحقيق هذا الهدف، نقدم تقنية ناشئة بسرعة، وهي الاستشعار البيولوجي للتأثير الميداني (FEB)، لتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية المحددة. FEB هي تقنية للكشف عن الجزيئات الحيوية على الطاولة وخالية من الملصقات وموثوقة لتحديد تفاعلات محددة وتستخدم أجهزة استشعار حيوية إلكترونية عالية الجودة. يمكن لتقنية FEB مراقبة التفاعلات في نطاق nanomolar بسبب المواد النانوية المتوافقة بيولوجيا المستخدمة على سطح المستشعر الحيوي. وكدليل على المفهوم، تم توضيح التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) بين بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) ودورة انقسام الخلايا 37 (Cdc37). Hsp90 هو مرافقة جزيئية تعتمد على ATP تلعب دورا أساسيا في طي واستقرار ونضج ومراقبة جودة العديد من البروتينات ، وبالتالي تنظيم وظائف خلوية حيوية متعددة. يعتبر Cdc37 مرافقا جزيئيا خاصا بالبروتين كيناز ، لأنه يتعرف على وجه التحديد على كينازات البروتين ويجندها إلى Hsp90 لتنظيم مسارات نقل الإشارة في المصب. على هذا النحو ، يعتبر Cdc37 مرافقا مشاركا ل Hsp90. يتم تنشيط مسار كيناز المرافق (مجمع Hsp90 / Cdc37) بشكل مفرط في الأورام الخبيثة المتعددة التي تعزز النمو الخلوي. لذلك ، فهو هدف محتمل لعلاج السرطان. توضح هذه الدراسة كفاءة تقنية FEB باستخدام نظام النموذج Hsp90/Cdc37. اكتشف FEB مؤشر PPI قوي بين البروتينين (قيم KD من 0.014 ميكرومتر ، 0.053 ميكرومتر ، و 0.072 ميكرومتر في ثلاث تجارب مستقلة). باختصار ، FEB هي منصة للكشف عن PPI خالية من الملصقات وفعالة من حيث التكلفة ، والتي توفر قياسات سريعة ودقيقة.

نتائج التجربة 1: تم تجميد البروتين المستهدف Hsp90 (500 نانومتر) إلى الشريحة باتباع بروتوكول تثبيت الهدف كما هو موضح أعلاه. بالنسبة للتجربة الأولى ، تم إعداد 10 تركيزات من البروتين التحليلي ، Cdc37 ، تتراوح من 25 نانومتر إلى 5000 نانومتر ، بناء على البيانات المتاحة في الأدبيات (انظر الجد...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني (FEB) هو تقنية خالية من الملصقات للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية. يقيس التيار الكهربائي من خلال المستشعر الحيوي للجرافين الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تم استخدام تقنية FEB لتقييم التفاعلات الجزيئية الحيوية بين Hsp90 و Cdc37 وتم اكتشاف تفاعل قوي بين البروتينين.

استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB هي منصة للكشف عن التفاعل خالية من الملصقات وفعالة من حيث التكلفة _ توفر قياسات سريعة ودقيقة. توفر هذه الطريقة التحقق من صحة التفاعلات المعروفة أو غير المعروفة وطريقة سهلة لاختبار المثبطات المحتملة للتفاعلات الجزيئية الحيوية. الميزة الرئيسية ل FEB هي برنامجها الآلي سهل الاستخدام الذي يخطر المستخدم طوال التجربة باستخدام منصة سحب يدوية مفتوحة ، مما يتيح للمستخدمين العمل مع القليل من التدريب أو حتى بدون تدريب.تقدم تقنية FEB أيضا تطبيقات في مجالات متنوعة من المستحضرات الصيدلانية ، والتحليل الجزيئي الحيوي للجزيئات الصغيرة ، والببتيدات والبروتينات ، والتحقق من صحة الأدوية عن طريق ترجمة النشاط البيولوجي في المختبر بسهولة إلى فعالية في الجسم الحي. كونك مبتدئا ، قد تواجه تحديات في اختيار تركيزات التحليل المناسبة لتحسين التجربة للحصول على قيمة دينار كويتي موثوقة. ننصح بإيلاء الاهتمام لعملية تشغيل الشريحة وتبادل المخزن المؤقت المناسب.ابدأ بخلط كميات متساوية من محلول EDC و sulfo-NHS عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ضع شريحة الاستشعار الحيوي التي توفرها الشركة في طبق بتري زجاجي مع غطاء مجهز. يقترح أن تتم جميع خطوات التشغيل الوظيفية التي ينطوي عليها تنشيط الرقاقة داخل طبق Petri.ضع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES أحادي المولي على شريحة المستشعر الحيوي. احتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت وتطبيق 50 ميكرولتر من محلول EDC sulfo-NHS على الفور على شريحة الاستشعار.يغطى طبق بتري ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول EDC sulfo-NHS من الشريحة وطبق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES ذو المولي الواحد. قم بشفط MES المخزن المؤقت وشطف الشريحة مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS.استنشق PBS من الشريحة وأضف الجزيء المستهدف Hsp90. قم بتغطية طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم ، استنشق المحلول الذي يحتوي على الجزيء المستهدف وشطفه ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS.استنشق محلول 1X PBS من الشريحة وأضف 50 ميكرولتر من محلول التبريد الواحد. يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشاق محلول واحد من الشريحة وإضافة 50 ميكرولتر من محلول التبريد اثنين.يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول التبريد من الشريحة وشطف الشريحة خمس مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS تاركا آخر قطرة PBS على المستشعر. قم بإعداد سلسلة التخفيف التحليلي ل Cdc37 في نطاق التركيز المطلوب.صمم التجربة لتشمل ما لا يقل عن ثمانية تركيزات تحليلية مختلفة للحصول على ثابت تفكك موثوق به ، أو قيمة KD ، وإعداد هذه التخفيفات المختلفة في نفس المخزن المؤقت المستخدم في المعايرة والبروتين المستهدف. ضع الشريحة بعناية على الأداة. تأكد من تشغيل البرنامج وتحول ضوء LED إلى اللون الأخضر.بعد ذلك ، اضغط على وحدة Run Experiment النمطية على البرنامج الآلي واختر 10 نقاط مع التجديد أو أي بروتوكول آخر مطلوب. املأ التفاصيل مثل اسم المشغل واسم التجربة والتاريخ والمخزن المؤقت للتجديد والهدف المعطل والتحليل في الحل. اضغط على الزر بدء التجربة المعروض على البرنامج واتبع الإرشادات التي يعرضها البرنامج التلقائي.لإجراء معايرة الأداة، قم بشفط محلول PBS المتبقي من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمعايرة. اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة المعايرة. يعرض البرنامج نقطة النهاية المحددة لخطوة المعايرة مع إنذار تحذير للمتابعة.بعد ذلك ، قم بإجراء ارتباط تحليلي عن طريق شفط مخزن المعايرة المؤقت من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من أدنى تركيز تحليلي. اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة الاقتران. يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الاقتران مع إنذار تحذير للمتابعة.لإجراء فصل تحليلي ، استنشق محلول التحليل من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانفصال. اضغط على زر متابعة. بعد مدة خطوة الانفصال ، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الانفصال مع إنذار تحذير.بعد ذلك ، قم بإجراء تجديد الرقاقة عن طريق شفط محلول التفكك من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن التجديد. ثم اضغط على الزر متابعة. تستغرق خطوة التجديد عادة حوالي 30 ثانية حتى تنتهي.بعد ذلك ، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التجديد مع إنذار تحذيري للمتابعة. أخيرا ، لغسل الشريحة ، قم بشفط محلول التجديد من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت. استنشق المحلول من الشريحة وكرر ذلك خمس مرات.اترك آخر قطرة من المخزن المؤقت للغسيل على الشريحة. ثم اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة الغسيل في شاشة البرنامج. كرر الخطوات لكل تركيز تحليل مستخدم.تشكل الخطوات الخمس للمعايرة وتحليل الارتباط والتفكك والتجديد والغسيل خمس مرات دورة واحدة. اضغط على زر التحليل في برنامج التحليل الآلي في نهاية التجربة. ستظهر نافذة عرض تحتوي على جميع النقاط التجريبية.تأكد من صحة تركيزات التحليل المستخدمة في البروتوكول المحدد. اضغط على زر تشغيل التحليل لإنشاء قيمة الدينار الكويتي تلقائيا. يقوم البرنامج بإنشاء مخطط مناسب للتلة عن طريق رسم تركيزات التحليل مقابل استجابات I-Id المقابلة التي يتم من خلالها حساب ثابت التفكك عند التوازن.تم تجميد البروتين المستهدف Hsp90 إلى الشريحة ، وبالنسبة للتجربة الأولى ، تم إعداد 10 تركيزات من البروتين التحليلي Cdc37 تتراوح من 25 نانومولس إلى 5000 نانومول. تم عرض ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة الأولى هنا. يتم عرض البيانات التجريبية التي تم رصدها في الوقت الفعلي هنا.يتوافق المحور Y مع استجابة I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي ، ويتوافق المحور X مع النقاط الزمنية المختلفة وتركيزات التحليل في التجربة. تمثل الصورة الرسومية الموضحة هنا مخطط التل المناسب الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور Y مع الاستجابة I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي ، ويتوافق المحور X مع تركيزات التحليل المختلفة في التجربة.تمثل الصورة الرسومية المعروضة هنا مخطط الارتباط الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور Y مع الاستجابة I في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور X مع التركيزات المختلفة للتحليل Cdc37. في التجربة الثانية، تم استخدام مجموعة مختلفة من التركيزات التي تتراوح من 0.4 نانومولار إلى 200 نانومولار، وتظهر ملفات البيانات التي تم إنشاؤها هنا.تمثل الصور الرسومية مخطط الحرارة ITC لتفاعل Hsp90 و Cdc37. تظهر هنا المنحنيات المتطورة للحرارة المقابلة التي تم الحصول عليها بسبب الحقن المتتالية ل Cdc37 في Hsp90 عند 298.15 كلفن. القوة التفاضلية المستخدمة هنا هي دالة للوقت.تحدد نقاط البيانات المتكاملة في هذه المؤامرة الحرارة الطبيعية المقابلة مقابل نسبة مولر من Hsp90 إلى Cdc37. يتطلب نهج السحب المفتوح المستخدم هنا أن يكون لدى المستخدم إتقان أساسي للسحب اليدوي ، مع التأكد من عدم لمس المستشعر الحيوي بالحافة. تعتمد قابلية تكرار توقيت الخطوة بالكامل على المستخدم.بمجرد أن يميز الباحث تفاعلا بين جزيئين حيويين ، يمكننا إجراء تجربة فحص من خلال تصميم مثبطات أو معدلات محتملة تستهدف التفاعل الجزيئي الحيوي المحدد باستخدام نظام FEB. يمكن استخدام هذا الإجراء لتحديد التفاعل المعروف والجديد بين البروتينات والتحقق منه وقياسه كميا ، وكذلك الجزيئات الصغيرة ، بما في ذلك الأدوية والببتيدات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...