Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Binational Science Foundation (BSF) aan S.K.S. en N.Q.

OPMERKING: De recombinante eiwitten die in deze studie werden gebruikt, Hsp90 en Cdc37, werden commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).
1. Chip activering
OPMERKING: Alle materialen die in het experiment moeten worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen. Filtreer alle bereide oplossingen door een steriel filter van 0,2 μm.
<ol><li>Bereid 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide (ED...

In deze studie werd de haalbaarheid van het gebruik van de FEB-technologie (een real-time kinetische karakteriseringsbenadering) geëvalueerd om de biomoleculaire interactie tussen Hsp90 en Cdc37 te bepalen. Het eerste verkennende experiment (eerste experiment) suggereerde dat het kiezen van de juiste analytconcentraties een cruciaal onderdeel van het experiment is en dat het experiment moet worden ontworpen door concentratiepunten boven en onder de KD-waarde op te nemen, die werden voorspeld op basis van de g...

Biomoleculaire interacties: Eiwitten zijn essentiële onderdelen van organismen en nemen deel aan tal van moleculaire routes zoals celmetabolisme, celstructuur, celsignalering, immuunresponsen, celadhesie en meer. Hoewel sommige eiwitten hun functie(s) onafhankelijk uitvoeren, interageren de meeste eiwitten met andere eiwitten met behulp van een bindende interface om de juiste biologische activiteit te coördineren1.
Biomoleculaire interacties kunnen voornamelijk worden geclassificeerd op basis van de verschillende structurele en functionele kenmerken van betrokken eiwitten2, bijvoorbeeld op basis van de eiwitoppervlakken, de complexe stabiliteit of de persistentie van interacties3. Het identificeren van essentiële eiwitten en hun rol in biomoleculaire interacties is van vitaal belang voor het begrijpen van biochemische mechanismen op moleculair niveau4. Momenteel zijn er verschillende benaderingen om deze interacties5 te detecteren: in vitro6, in silico7, in levende cellen8, ex vivo9 en in vivo10 met elk zijn eigen sterke en zwakke punten.
De in vivo assays worden uitgevoerd met behulp van het hele dier als een experimenteel hulpmiddel11, ende ex vivo assays worden uitgevoerd op weefselextracten of hele organen (bijv. Hart, hersenen, lever) in een gecontroleerde externe omgeving door minimale veranderingen in natuurlijke omstandigheden te bieden. De meest voorkomende toepassing van in vivo en ex vivo studies is het evalueren van de farmacokinetiek, farmacodynamiek en toxiciteitseffecten van potentiële farmacologische agentia vóór proeven bij mensen door hun algehele veiligheid en werkzaamheid te waarborgen12.
Biomoleculaire interacties kunnen ook worden gedetecteerd in levende cellen. Beeldvorming van levende cellen stelt ons in staat om dynamische interacties te observeren terwijl ze de reacties van een bepaalde biochemische route uitvoeren13. Bovendien kunnen detectietechnieken, zoals bioluminescentie of fluorescentieresonantie-energieoverdracht, informatie geven over waar en wanneer deze interacties plaatsvinden in de cel14. Hoewel detectie in levende cellen cruciale details biedt, vertrouwen deze detectiemethoden op optica en labels, die mogelijk niet de inheemse biologie weerspiegelen; ze zijn ook minder gecontroleerd dan in vitro methoden en vereisen gespecialiseerde expertise om15 uit te voeren.
De in silico computationele methoden worden voornamelijk gebruikt voor grootschalige screening van doelmoleculen vóór de in vitro experimenten. Computationele voorspellingsmethoden, computergebaseerde databases, moleculaire docking, kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties en andere moleculaire dynamica-simulatiebenaderingen behoren tot de gevestigde in silico-tools 16. In vergelijking met moeizame experimentele technieken kunnen de in silico-tools gemakkelijk voorspellingen doen met een hoge gevoeligheid, maar met verminderde nauwkeurigheid in voorspellende prestaties17.
In vitro assays worden uitgevoerd met micro-organismen of biologische moleculen buiten hun standaard biologische context. Het weergeven van biomoleculaire interacties door middel van in vitro methoden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfuncties en de biologie achter het complexe netwerk van celfuncties. De voorkeurstestmethodologie wordt gekozen op basis van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, kinetische waarden en de wijze en intensiteit van interacties18,19.
De interactie Hsp90/Cdc37: De chaperonne-kinaseroute, die Hsp90 en Cdc37 verbindt, is een veelbelovend therapeutisch doelwit in de tumorbiologie20. Hsp90 speelt een centrale rol in de controle van de celcyclus, eiwitassemblage, celoverleving en signaalroutes. Eiwitten die afhankelijk zijn van Hsp90 voor hun functies worden geleverd aan Hsp90 voor complexatie via een co-chaperonne, zoals Cdc37. Het Hsp90/Cdc37-complex regelt de vouwing van de meeste eiwitkinasen en dient als hub voor een groot aantal intracellulaire signaleringsnetwerken21. Het is een veelbelovend antitumordoel vanwege de verhoogde expressie in verschillende maligniteiten, waaronder acute myeloblastische leukemie, multipel myeloom en hepatocellulair carcinoom22,23.
Veelgebruikte in vitro biomoleculaire interactie detectietechnieken Co-immunoprecipitatie (co-IP) is een techniek die vertrouwt op antigeen-antilichaamspecificiteit om biologisch relevante interacties te identificeren24. Het belangrijkste nadeel van deze methode is het onvermogen om interacties met lage affiniteit en kinetische waarden te detecteren24. Biofysische methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en FEB-technologie hebben de voorkeur om de kinetische waarden te bepalen.
ITC is een biofysische detectiemethode gebaseerd op de bepaling van bindingsenergie samen met een volledige thermodynamica-analyse om biomoleculaire interacties te karakteriseren25. Het belangrijkste voordeel van ITC is dat het geen etikettering of fixatie van het doeleiwit vereist. De belangrijkste problemen die ITC ondervindt, zijn de hoge concentratie doeleiwit die nodig is voor één experiment en de moeilijkheid om niet-covalente complexen te analyseren als gevolg van kleine bindende enthalpies26. Zowel SPR als BLI zijn labelvrije biofysische technieken die afhankelijk zijn van de immobilisatie van het doelmolecuul op het sensoroppervlak, gevolgd door daaropvolgende injecties van de analyt over het geïmmobiliseerde doel27,28. In SPR worden veranderingen in de brekingsindex tijdens biomoleculaire interacties gemeten27; in BLI wordt de interferentie in gereflecteerd licht in real-time geregistreerd als een verandering in golflengte als functie van tijd28. Zowel SPR als BLI delen gemeenschappelijke voordelen van het aanbieden van hoge specificiteit, gevoeligheid en detectiemogelijkheden29. In beide methoden wordt het doeleiwit geïmmobiliseerd op biosensoroppervlakken en daarom kan er enig verlies zijn van de oorspronkelijke conformatie van het doelwit, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen specifieke versus niet-specifieke interacties30. BLI gebruikt dure wegwerpbare glasvezelbiosensoren om het doelwit te immobiliseren en is daarom een kostbare techniek31. In vergelijking met deze gevestigde biomoleculaire detectietools biedt FEB-technologie een betrouwbaar en labelvrij platform door lage nanomolelarconcentraties te gebruiken voor biomoleculaire detectie in realtime met kinetische karakterisering. De FEB-technologie overwint ook de borrelende uitdagingen in ITC en is kosteneffectiever in vergelijking met SPR of BLI.
De op veldeffecttransistor (FET) gebaseerde biosensoren is een opkomend veld voor het detecteren van biomoleculaire interacties door gevarieerde biomedische toepassingen aan te bieden. In het FET-systeem worden doelen geïmmobiliseerd naar de biosensorchips en interacties worden gedetecteerd door veranderingen in geleiding32. Het unieke kenmerk waarmee rekening moet worden gehouden bij de ontwikkeling van een efficiënte elektronische biosensor zijn de fysisch-chemische eigenschappen zoals de semi-geleidende aard en chemische stabiliteit van het coatingmateriaal dat wordt gebruikt om het sensoroppervlak te fabriceren33. Conventionele materialen zoals silicium die voor FET worden gebruikt, hebben de gevoeligheid van sensoren beperkt omdat het oxidelagen vereist die ingeklemd zitten tussen het transistorkanaal en een specifieke omgeving voor een goede werking34. Bovendien zijn siliciumtransistors gevoelig voor zoutrijke omgevingen, waardoor het moeilijk is om biologische interacties in hun natuurlijke omgeving te meten. De op grafeen gebaseerde biosensor wordt gepresenteerd als een alternatief omdat het een uitstekende chemische stabiliteit en elektrisch veld biedt. Aangezien grafeen een enkele atomaire laag koolstof is, is het zowel extreem gevoelig als een halfgeleider en chemisch compatibel met biologische oplossingen; beide kwaliteiten zijn wenselijk om compatibele elektronische biosensoren te genereren35. Het opmerkelijke ultrahoge laadpotentieel van biomoleculen dat wordt geboden door biosensoren met grafeencoating, leidt tot de ontwikkeling van op grafeen gebaseerde biosensoren FEB-technologie.
Principe van FEB-technologie: FEB is een labelvrije biomoleculaire detectietechniek die de elektrische stroom meet door de grafeenbiosensor waaraan de bindingsdoelen worden geïmmobiliseerd. Interacties tussen het geïmmobiliseerde eiwit en de analyt resulteren in veranderingen in de stroom die in realtime worden gemonitord, waardoor nauwkeurige kinetische metingenmogelijk zijn 36.
Instrumentatie: Het FEB-systeem bestaat uit een grafeenveldeffecttransistor (gFET) sensorchip en een elektronische lezer die gedurende het hele experiment een constante spanning toepast (figuur 1). De analyt wordt in oplossing aangebracht op het doeleiwit dat op het biosensoroppervlak is geïmmobiliseerd. Wanneer een interactie optreedt, wordt een verandering in de stroom gemeten en in realtime geregistreerd. Naarmate de analytconcentratie toeneemt, zal ook de fractie van gebonden analyt toenemen, waardoor hogere wisselingen in de stroom ontstaan. Met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware die bij het instrument wordt geleverd (Tabel van materialen), wordt I-Respons gemeten en geregistreerd in termen van biosensing units (BU)37. I-Respons wordt gedefinieerd als de verandering in de stroom (I) door de biosensorchip gemeten in real-time bij de interactie van het geïmmobiliseerde doelwit met de analyt. De geautomatiseerde analysesoftware van het VBO kan zowel de I-Respons als de C-Respons op dynamische interactiegebeurtenissen analyseren, waarbij de C-Respons de veranderingen in de capaciteit (C) registreert. De variaties in zowel de I-Respons als de C-Respons komen direct overeen met de fractie van gebonden analyt en kunnen verder worden geanalyseerd om KD-waarden te genereren. De standaardvoorkeur van de geautomatiseerde analysesoftware is I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de experimentele opstelling. (A) Op grafeen gebaseerde chip en een elektronische lezer. (B) Een overzicht van de chipcomponenten. De chip is bevestigd aan twee elektroden die stroom leveren aan het systeem. Het oppervlak van de chip is bedekt met grafeen, dat bij activering het doelwit kan binden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Methodologie: In eerste instantie wordt de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat ingebracht (figuur 1), gevolgd door de uitvoering van de onderstaande stappen: (1) Kalibratie: Het experiment begint met systeemkalibratie met behulp van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; pH = 7,4) om de basislijn equilibratierespons te creëren. (2) Associatie: De analyt wordt in de chip geïntroduceerd en de I-respons wordt gemonitord totdat de bindingsverzadiging is bereikt. (3) Dissociatie: De analyt wordt gedissocieerd met behulp van 1x PBS. (4) Regeneratie: Restanten van de analyt worden verwijderd met behulp van 1x PBS. (5) Wassen: In totaal worden vijf wasbeurten uitgevoerd met behulp van 1x PBS voor het grondig verwijderen van de gebonden en ongebonden analyten uit de chip.
Analyse: Data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van de volledig geautomatiseerde software die bij het instrument wordt geleverd. De geautomatiseerde analysesoftware genereert een Hill fit plot met eenKD-waarde . De Hill fit plot beschrijft de associatie van een analyt met het doeleiwit als functie van analytconcentraties. De concentratie waarbij een half-maximale respons wordt bereikt, is evenredig met de KD-waarde . Een lageKD-waarde vertegenwoordigt een hoge bindingsaffiniteit en vice versa.
Om de gegevens verkregen uit het VBO-experiment te valideren, worden I-responsen geëxtraheerd uit elk uitleespunt voor elke analytconcentratie met behulp van de data review/export software en kunnen ze worden geëxporteerd naar andere statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) zoals hieronder uitgelegd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biomoleculaire interacties spelen een veelzijdige rol in tal van cellulaire processen door functioneel relevante biologische gebeurtenissen te reguleren en te coördineren. Biomoleculen zoals eiwitten, koolhydraten, vitamines, vetzuren, nucleïnezuren en enzymen zijn fundamentele bouwstenen van levende wezens; ze verzamelen zich in complexe netwerken in biosystemen om een groot aantal levensgebeurtenissen te synchroniseren. Eiwitten maken meestal gebruik van complexe interactoomnetwerken om hun functies uit te voeren; daarom is het verplicht om dergelijke interacties te evalueren om hun belang in cellen op zowel cellulair als organismeniveau te ontrafelen. Om dit doel te bereiken, introduceren we een snel opkomende technologie, field-effect biosensing (FEB), om specifieke biomoleculaire interacties te bepalen. FEB is een benchtop, labelvrije en betrouwbare biomoleculaire detectietechniek om specifieke interacties te bepalen en maakt gebruik van hoogwaardige elektronische biosensoren. De FEB-technologie kan interacties in het nanomolaire bereik volgen vanwege de biocompatibele nanomaterialen die op het biosensoroppervlak worden gebruikt. Als proof of concept werd de eiwit-eiwitinteractie (PPI) tussen heat shock protein 90 (Hsp90) en celdelingscyclus 37 (Cdc37) opgehelderd. Hsp90 is een ATP-afhankelijke moleculaire chaperonne die een essentiële rol speelt bij het vouwen, stabiliteit, rijping en kwaliteitscontrole van veel eiwitten, waardoor meerdere vitale cellulaire functies worden gereguleerd. Cdc37 wordt beschouwd als een eiwitkinase-specifieke moleculaire chaperonne, omdat het specifiek eiwitkinasen voor Hsp90 herkent en rekruteert om hun stroomafwaartse signaaltransductieroutes te reguleren. Als zodanig wordt Cdc37 beschouwd als een co-chaperonne van Hsp90. De chaperonnekinaseroute (Hsp90/Cdc37-complex) is hypergeactiveerd bij meerdere maligniteiten die cellulaire groei bevorderen; daarom is het een potentieel doelwit voor kankertherapie. De huidige studie toont de efficiëntie van feb-technologie met behulp van het Hsp90/Cdc37-modelsysteem. FEB detecteerde een sterke PPI tussen de twee eiwitten (KD-waarden van 0,014 μM, 0,053 μM en 0,072 μM in drie onafhankelijke experimenten). Kortom, het VBO is een labelvrij en kosteneffectief PPI-detectieplatform, dat snelle en nauwkeurige metingen biedt.

Resultaten van experiment 1: Het doeleiwit Hsp90 (500 nM) werd geïmmobiliseerd naar de chip volgens het doelimmobilisatieprotocol zoals hierboven beschreven. Voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nM tot 5.000 nM, bereid op basis van de beschikbare gegevens in de literatuur (zie tabel 1).
De stappen van het experiment kunnen in realtime worden gevolgd door de veranderingen in de I-respons te volgen (...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Het VBO is een labelvrij en kosteneffectief _______ ________ interactiedetectieplatform dat snelle en nauwkeurige metingen biedt. Deze methode biedt validatie van bekende of onbekende interacties en een eenvoudige manier om te testen op potentiële remmers van de biomoleculaire interacties. Het belangrijkste voordeel van het VBO is de geautomatiseerde, gebruiksvriendelijke software die de gebruiker gedurende het hele experiment beschermt met een open, handpipettersplatform, waardoor gebruikers met weinig of zelfs geen training kunnen werken.FEB-technologie biedt ook toepassingen op verschillende gebieden van farmaceutica, biomoleculaire analyse van kleine moleculen, peptiden en eiwitten, medicijnvalidatie door in vitro biologische activiteit gemakkelijk te vertalen in in vivo werkzaamheid. Als beginner kunt u uitdagingen tegenkomen bij het kiezen van de juiste analytconcentraties om het experiment te optimaliseren om een betrouwbare KD-waarde te krijgen. Wij adviseren om aandacht te besteden aan het chip functionalisatie proces en een goede buffer uitwisseling.Begin met het mengen van gelijke volumes EDC en sulfo-NHS-oplossing door op en neer te pipetteren. Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip in een glazen petrischaaltje met een deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd.Breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan op de biosensorchip. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Aspiraleer vervolgens de buffer en breng onmiddellijk 50 microliter EDC sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip.Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de EDC sulfo-NHS-oplossing uit de chip en breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan. Zuig mes-buffer op en spoel de chip twee keer met 50 microliter 1x PBS.Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 toe. Bedek de glazen petrischaal en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de oplossing met het doelmolecuul aan en spoel drie keer met 50 microliter 1x PBS.Zuig de 1X PBS-oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de blusoplossing toe. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de blusoplossing één oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de bluss twee-oplossing toe.Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig daarna de blusoplossing twee uit de chip en spoel de chip vijf keer met 50 microliter 1X PBS waardoor de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft. Bereid de analytverdunningsreeks voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik.Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare dissociatieconstante of KD-waarde te verkrijgen en bereid deze verschillende verdunningen voor in dezelfde buffer die wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit. Plaats de chip voorzichtig op het instrument. Zorg ervoor dat de software is ingeschakeld en dat het LED-lampje groen wordt.Druk vervolgens op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de details in zoals operatornaam, experimentnaam, datum, regeneratiebuffer, geïmmobiliseerd doel en de analyt in oplossing. Druk op de knop Experiment beginnen die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven.Om de instrumentkalibratie uit te voeren, zuigt u de resterende PBS-oplossing uit de chip aan en brengt u 50 microliter van de kalibratiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap met een waarschuwingsalarm om op te volgen.Voer vervolgens een analytassociatie uit door de kalibratiebuffer van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de laagste analytconcentratie toe te passen. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer voor de koppelingsstap met een waarschuwingsalarm om door te gaan.Om een analytdissociatie uit te voeren, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de dissociatiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan. Na de duur van de dissociatiestap geeft de software het eindpunt voor de dissociatiestap weer met een waarschuwingsalarm.Voer vervolgens chipregeneratie uit door de dissociatieoplossing van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de regeneratiebuffer aan te brengen. Druk vervolgens op de knop Doorgaan. De regeneratiestap duurt meestal ongeveer 30 seconden om te voltooien.Daarna geeft de software het eindpunt voor de regeneratiestap weer met een waarschuwingsalarm om op te volgen. Ten slotte, om de chip te wassen, zuigt u de regeneratieoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de wasbuffer aan. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit vijf keer.Laat de laatste druppel van de wasbuffer op de chip zitten. Druk vervolgens op de knop Doorgaan en wacht 30 seconden totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay. Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie.De vijf stappen van de kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en vijf keer wassen vormen één cyclus. Druk op de knop Analyse in de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten.Zorg ervoor dat de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn. Druk op de knop Analyse uitvoeren om de KD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht wordt berekend.Het doeleiwit Hsp90 werd geïmmobiliseerd naar de chip en voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nanomolars tot 5.000 nanomolars, bereid. De gegevensbestanden die zijn gegenereerd uit experiment één zijn hier weergegeven. De experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord, worden hier weergegeven.De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. De hier getoonde grafische afbeelding geeft de hill fit plot weer die is gegenereerd door de geautomatiseerde analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende analytconcentraties in het experiment.De hier getoonde grafische afbeelding vertegenwoordigt de associatieplot die is gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons aan het einde van de associatiefase en de X-as komt overeen met de verschillende concentraties van de analyt Cdc37. In experiment twee werd een verschillende reeks concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nanomolair tot 200 nanomolair, en de gegenereerde gegevensbestanden worden hier weergegeven.De grafische afbeeldingen vertegenwoordigen het ITC-thermogram van Hsp90- en Cdc37-interactie. Hier worden de overeenkomstige warmte-evoluerende curven getoond die worden verkregen als gevolg van de opeenvolgende injecties van Cdc37 in Hsp90 bij 298,15 Kelvin. Het differentiële vermogen dat hier wordt gebruikt, is een functie van de tijd.De geïntegreerde gegevenspunten in deze grafiek geven de overeenkomstige genormaliseerde warmte aan versus de Mueller-verhouding van Hsp90 tot Cdc37. De open pipetteerbenadering die hier wordt gebruikt, vereist dat de gebruiker een basisbeheersing van handpipetters heeft, waarbij hij ervoor zorgt dat de biosensor niet met de punt wordt aangeraakt. De reproduceerbaarheid van de staptiming hangt volledig af van de gebruiker.Zodra de onderzoeker een interactie tussen twee biomoleculen karakteriseert, kunnen we een screeningsexperiment uitvoeren door potentiële remmers of modulatoren te ontwerpen die zich richten op de specifieke biomoleculaire interactie met behulp van het FEB-systeem. Deze procedure kan worden gebruikt om bekende en nieuwe interactie tussen eiwitten en kleine moleculen, waaronder geneesmiddelen en peptiden, te identificeren, verifiëren en kwantificeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...