Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Binational Science Foundation (BSF) til S.K.S. og N.Q.

MERK: De rekombinante proteinene som ble brukt i denne studien, Hsp90 og Cdc37, ble kommersielt oppnådd (se Materialfortegnelser).
1. Chip aktivering
MERK: Alle materialer som skal brukes i eksperimentet er oppført i materialtabellen. Filtrer alle forberedte løsninger gjennom et sterilt 0,2 μm filter.
<ol><li>Forbered 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) karbodiimid (EDC) oppløsning ved å tilsette 2 mg EDC til...

I denne studien ble muligheten for å bruke FEB-teknologien (en kinetisk karakteriseringstilnærming i sanntid) evaluert for å bestemme den biomolekylære interaksjonen mellom Hsp90 og Cdc37. Det første utforskende eksperimentet (første eksperiment) antydet at valg av riktige analyttkonsentrasjoner er en kritisk del av eksperimentet, og at eksperimentet bør utformes ved å inkludere konsentrasjonspunkter over og under KD-verdien , som ble spådd basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen.
<...

Biomolekylære interaksjoner: Proteiner er essensielle deler av organismer og deltar i mange molekylære veier som cellemetabolisme, cellestruktur, cellesignalering, immunresponser, celleadhesjon og mer. Mens noen proteiner utfører sin funksjon (er) uavhengig, samhandler de fleste proteiner med andre proteiner ved hjelp av et bindende grensesnitt for å koordinere riktig biologisk aktivitet1.
Biomolekylære interaksjoner kan hovedsakelig klassifiseres basert på de distinkte strukturelle og funksjonelle egenskapene til proteiner involvert2, for eksempel basert på proteinoverflatene, den komplekse stabiliteten eller utholdenheten til interaksjoner3. Identifisering av essensielle proteiner og deres roller i biomolekylære interaksjoner er avgjørende for å forstå biokjemiske mekanismer på molekylærnivå4. For tiden er det forskjellige tilnærminger for å oppdage disse interaksjonene5: in vitro6, i silico7, i levende celler8, ex vivo9 og in vivo10 med hver har sine egne styrker og svakheter.
In vivo-analysene utføres ved hjelp av hele dyret som et eksperimentelt verktøy11, oghan eks vivo-analyser utføres på vevsekstrakter eller hele organer (f.eks. hjerte, hjerne, lever) i et kontrollert eksternt miljø ved å gi minimale endringer i naturlige forhold. Den vanligste anvendelsen av in vivo- og ex vivo-studier er å evaluere farmakokinetikk, farmakodynamikk og toksisitetseffekter av potensielle farmakologiske midler før menneskelige studier ved å sikre deres generelle sikkerhet og effekt12.
Biomolekylære interaksjoner kan også påvises i levende celler. Imaging levende celler tillater oss å observere dynamiske interaksjoner som de utfører reaksjonene av en bestemt biokjemisk vei13. Videre kan deteksjonsteknikker, for eksempel bioluminescens eller fluorescensresonansenergioverføring, gi informasjon om hvor og når disse interaksjonene skjer i celle14. Selv om deteksjon i levende celler gir viktige detaljer, er disse deteksjonsmetodene avhengige av optikk og etiketter, noe som kanskje ikke gjenspeiler den opprinnelige biologien; de er også mindre kontrollerte enn in vitro-metoder og krever spesialisert kompetanse for å utføre15.
I silico beregningsmetoder brukes primært til storskala screening av målmolekyler før in vitro-forsøkene. Beregningsmessige prediksjonsmetoder, databaserte databaser, molekylær dokking, kvantitative strukturaktivitetsrelasjoner og andre molekylære dynamikksimuleringsmetoder er blant de veletablerte i silicoverktøy 16. Sammenlignet med arbeidskrevende eksperimentelle teknikker, kan in silico-verktøyene enkelt gjøre spådommer med høy følsomhet, men med redusert nøyaktighet i prediktiv ytelse17.
In vitro-analyser utføres med mikroorganismer eller biologiske molekyler utenfor deres standard biologiske kontekst. Skildring av biomolekylære interaksjoner gjennom in vitro-metoder er avgjørende for å forstå proteinfunksjoner og biologien bak det komplekse nettverket av cellefunksjon. Den foretrukne analysemetodikken velges i henhold til proteinets iboende egenskaper, kinetiske verdier og modusen og intensiteten av interaksjoner 18,19.
Hsp90/Cdc37-interaksjonen: Chaperone-kinase-banen, som forbinder Hsp90 og Cdc37, er et lovende terapeutisk mål i tumorbiologi20. Hsp90 spiller en sentral rolle i cellesykluskontroll, proteinmontering, celleoverlevelse og signalveier. Proteiner som er avhengige av Hsp90 for deres funksjoner, leveres til Hsp90 for kompleksitet gjennom en medprest, for eksempel Cdc37. Hsp90/Cdc37-komplekset styrer foldingen av de fleste proteinkinaser og fungerer som et knutepunkt for en rekke intracellulære signalnettverk21. Det er et lovende anti-tumor mål på grunn av sin forhøyede uttrykk i ulike maligniteter, inkludert akutt myeloblastisk leukemi, multippel myeloma, og hepatocellulært karsinom22,23.
Vanlige in vitro biomolekylære interaksjonsdeteksjonsteknikker Co-immunoprecipitation (co-IP) er en teknikk som er avhengig av antigen-antistoff spesifisitet for å identifisere biologisk relevante interaksjoner24. Den største ulempen ved denne metoden er dens manglende evne til å oppdage interaksjoner med lav affinitet og kinetiske verdier24. Biofysiske metoder som isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overflateplasmonresonans (SPR), biolayer interferometri (BLI) og FEB-teknologi foretrekkes for å bestemme kinetiske verdier.
ITC er en biofysisk deteksjonsmetode basert på bestemmelse av bindende energi sammen med en komplett termodynamikkanalyse for å karakterisere biomolekylære interaksjoner25. Den viktigste fordelen med ITC er at det ikke krever merking eller fiksering av målproteinet. De viktigste vanskelighetene som ITC møter er den høye konsentrasjonen av målprotein som kreves for ett eksperiment og vanskeligheten med å analysere ikke-kovalente komplekser på grunn av små bindende entalpier26. Både SPR og BLI er etikettfrie biofysiske teknikker som er avhengige av immobilisering av målmolekylet på sensoroverflaten, etterfulgt av påfølgende injeksjoner av analytten over det immobiliserte målet27,28. I SPR måles endringer i brytningsindeksen under biomolekylære interaksjoner27; I BLI registreres interferensen i reflektert lys i sanntid som en endring i bølgelengden som en funksjon av tid28. Både SPR og BLI deler felles fordeler ved å tilby høy spesifisitet, følsomhet og deteksjonsevne29. I begge metoder er målproteinet immobilisert på biosensoroverflater, og derfor kan det være noe tap av målets opprinnelige konformasjon, noe som gjør det vanskelig å diskriminere mellom spesifikke kontra ikke-spesifikke interaksjoner30. BLI bruker dyre engangs fiberoptiske biosensorer for å immobilisere målet, og er derfor en kostbar teknikk31. Sammenlignet med disse veletablerte biomolekylære deteksjonsverktøyene, tilbyr FEB-teknologi en pålitelig og etikettfri plattform ved å bruke lave nanomolarkonsentrasjoner for biomolekylær deteksjon i sanntid med kinetisk karakterisering. FEB-teknologien overvinner også de boblende utfordringene i ITC og er mer kostnadseffektiv sammenlignet med SPR eller BLI.
Den felteffekttransistor (FET) basert biosensorer er et fremvoksende felt for å oppdage biomolekylære interaksjoner ved å tilby varierte biomedisinske applikasjoner. I FET-systemet blir mål immobilisert til biosensorbrikkene og interaksjoner oppdages ved endringer i ledning32. Den unike egenskapen som skal vurderes i utviklingen av en effektiv elektronisk biosensor er de fysisk-kjemiske egenskapene som den halvledende naturen og kjemisk stabilitet av beleggmaterialet som brukes til å fremstille sensoroverflaten33. Konvensjonelle materialer som silisium som brukes til FET har begrenset følsomheten til sensorer fordi det krever oksidlag smurt mellom transistorkanalen og et spesifikt miljø for riktig funksjon34. Videre er silisiumtransistorer følsomme for høye saltmiljøer, noe som gjør det vanskelig å måle biologiske interaksjoner i sitt naturlige miljø. Den grafenbaserte biosensoren presenteres som et alternativ, da den tilbyr utmerket kjemisk stabilitet og elektrisk felt. Siden grafen er et enkelt atomlag av karbon, er det både ekstremt følsomt som en halvleder og kjemisk kompatibel med biologiske løsninger; begge disse egenskapene er ønskelige å generere kompatible elektroniske biosensorer35. Det bemerkelsesverdige ultrahøye lastepotensialet til biomolekyler som tilbys av grafenbelagte biosensorer fører til utvikling av grafenbaserte biosensorer FEB-teknologi.
Prinsipp for FEB-teknologi: FEB er en etikettfri biomolekylær deteksjonsteknikk som måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. Interaksjoner mellom det immobiliserte proteinet og analytten resulterer i endringer i strøm som overvåkes i sanntid, noe som muliggjør nøyaktige kinetiske målinger36.
Instrumentering: FEB-systemet består av en grafenfelteffekttransistorsensor (gFET) og en elektronisk leser som bruker konstant spenning gjennom hele eksperimentet (figur 1). Analytten påføres i løsning på målproteinet immobilisert på biosensoroverflaten. Når en interaksjon oppstår, måles og registreres en endring i strømmen i sanntid. Etter hvert som analyttkonsentrasjonen øker, vil brøkdelen av bundet analytt også øke, noe som forårsaker høyere vekslinger i strømmen. Ved hjelp av den automatiserte analyseprogramvaren som følger med instrumentet (Materialfortegnelse), måles og registreres I-Response når det gjelder biosensing-enheter (BU)37. I-Response er definert som endringen i den nåværende (I) gjennom biosensorbrikken målt i sanntid etter samspillet mellom det immobiliserte målet med analytten. Feb automatisert analyse programvare kan analysere både I-Response og C-Response til dynamiske interaksjon hendelser, der C-Response registrerer endringene i kapasitans (C). Variasjonene i både I-Response og C-Response samsvarer direkte med brøkdelen av bundet analytt og kan analyseres ytterligere for å generere KD-verdier . Standardinnstillingen for den automatiserte analyseprogramvaren er I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over det eksperimentelle oppsettet. (A) Grafenbasert brikke og en elektronisk leser. (B) En oversikt over brikkekomponentene. Brikken er festet til to elektroder som leverer strøm til systemet. Overflaten på brikken er dekket med grafen, som når den aktiveres kan binde målet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Metodikk: I utgangspunktet settes den aktiverte biosensorbrikken inn i FEB-enheten (figur 1) etterfulgt av utførelsen av trinnene som er beskrevet nedenfor: (1) Kalibrering: Eksperimentet starter med systemkalibrering ved hjelp av 1x fosfatbufret saltvann (PBS; pH = 7,4) for å skape baseline likevektsrespons. (2) Forening: Analytten innføres i brikken, og I-Response overvåkes til bindingsmetningen er nådd. (3) Dissosiasjon: Analytten er dissosiert ved hjelp av 1x PBS. (4) Regenerering: Rester av analytten fjernes ved hjelp av 1x PBS. (5) Vasking: Totalt fem vasker utføres ved hjelp av 1x PBS for grundig fjerning av de bundne og ubundne analyttene fra brikken.
Analyse: Dataanalyse utføres ved hjelp av den helautomatiske programvaren som følger med instrumentet. Den automatiserte analyseprogramvaren genererer en Hill fit-tomt med en KD-verdi . Hill fit plott beskriver foreningen av en analytt til målproteinet som en funksjon av analyttkonsentrasjoner. Konsentrasjonen der en halvmaksimal respons oppnås er proporsjonal med KD-verdien . En lav KD-verdi representerer høy bindingsaffinitet og omvendt.
For å validere dataene som er hentet fra FEB-eksperimentet, blir I-Responses hentet fra hvert avlesningspunkt for hver analyttkonsentrasjon ved hjelp av datagjennomgangs-/eksportprogramvaren og kan eksporteres til annen statistisk analyseprogramvare (se Tabell over materialer) som forklart nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biomolekylære interaksjoner spiller allsidige roller i en rekke cellulære prosesser ved å regulere og koordinere funksjonelt relevante biologiske hendelser. Biomolekyler som proteiner, karbohydrater, vitaminer, fettsyrer, nukleinsyrer og enzymer er grunnleggende byggesteiner i levende vesener; de samles i komplekse nettverk i biosystemer for å synkronisere et utall livshendelser. Proteiner bruker vanligvis komplekse interaktivitetsnettverk for å utføre sine funksjoner; Derfor er det obligatorisk å evaluere slike interaksjoner for å avdekke deres betydning i celler på både cellulære og organismenivåer. Mot dette målet introduserer vi en raskt fremvoksende teknologi, felteffekt biosensing (FEB), for å bestemme spesifikke biomolekylære interaksjoner. FEB er en stasjonær, etikettfri og pålitelig biomolekylær deteksjonsteknikk for å bestemme spesifikke interaksjoner og bruker elektroniske biosensorer av høy kvalitet. FEB-teknologien kan overvåke interaksjoner i nanomolarområdet på grunn av de biokompatible nanomaterialene som brukes på biosensoroverflaten. Som et konseptbevis ble proteinproteininteraksjonen (PPI) mellom varmesjokkprotein 90 (Hsp90) og celledelingssyklus 37 (Cdc37) belyst. Hsp90 er en ATP-avhengig molekylær anstand som spiller en viktig rolle i folding, stabilitet, modning og kvalitetskontroll av mange proteiner, og dermed regulerer flere vitale cellulære funksjoner. Cdc37 regnes som en protein kinase-spesifikk molekylær anstand, som det spesifikt anerkjenner og rekrutterer protein kinases til Hsp90 for å regulere deres nedstrøms signaltransduksjonsveier. Som sådan regnes Cdc37 som en med-anstand av Hsp90. Chaperone-kinase-banen (Hsp90/Cdc37-komplekset) er hyperaktivert i flere maligniteter som fremmer cellulær vekst; Derfor er det et potensielt mål for kreftbehandling. Den nåværende studien viser effektiviteten til FEB-teknologi ved hjelp av Hsp90 / Cdc37-modellsystemet. FEB oppdaget en sterk PPI mellom de to proteinene (KD-verdier på 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM i tre uavhengige eksperimenter). Oppsummert er FEB en etikettfri og kostnadseffektiv PPI-deteksjonsplattform, som tilbyr raske og nøyaktige målinger.

Resultater fra eksperiment 1: Målproteinet Hsp90 (500 nM) ble immobilisert til brikken etter mål-immobiliseringsprotokollen som beskrevet ovenfor. For det første eksperimentet ble 10 konsentrasjoner av analyttproteinet, Cdc37, fra 25 nM til 5000 nM, utarbeidet basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen (se tabell 1).
Trinnene i eksperimentet kan overvåkes i sanntid ved å følge endringene som skjer i I-Response (figur 3...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Field-effect biosensing (FEB) er en etikettfri teknikk for å oppdage biomolekylære interaksjoner. Den måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. FEB-teknologien ble brukt til å evaluere biomolekylære interaksjoner mellom Hsp90 og Cdc37, og det ble påvist et sterkt samspill mellom de to proteinene.

Utforske biomolekylær interaksjon mellom molekylær chaperone Hsp90 og dets klientprotein Kinase Cdc37 ved hjelp av field-effect biosensing teknologi

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB er en etikettfri og kostnadseffektiv ______ _______ interaksjonsdeteksjonsplattform som tilbyr raske og nøyaktige målinger. Denne metoden tilbyr validering av kjente eller ukjente interaksjoner og en enkel måte å teste for potensielle hemmere av biomolekylære interaksjoner. Den største fordelen med FEB er den automatiserte, brukervennlige programvaren som porter brukeren gjennom hele eksperimentet med åpen, håndpipetteringsplattform, slik at brukerne kan jobbe med lite eller til og med ingen opplæring.FEB-teknologi tilbyr også anvendelser innen ulike fagområder innen legemidler, biomolekylær analyse av små molekyler, peptider og proteiner, legemiddelvalidering ved å oversette in vitro biologisk aktivitet lett til in vivo-effekt. Som nybegynner kan du møte utfordringer med å velge de riktige analyttkonsentrasjonene for å optimalisere eksperimentet for å få en pålitelig KD-verdi. Vi anbefaler å gi oppmerksomhet til chipfunksjonaliseringsprosessen og riktig bufferutveksling.Begynn med å blande like store mengder EDC- og sulfo-NHS-oppløsning ved å pipettere opp og ned. Plasser biosensorbrikken som leveres av selskapet i en Petri-tallerken i glass med et montert lokk. Alle funksjonaliseringstrinnene som er involvert i chipaktivering, foreslås å gjøres i Petri-parabolen.Påfør 50 mikroliter med en-molar MES-buffer på biosensorbrikken. Inkuber i ett minutt ved romtemperatur. Aspirer deretter bufferen og påfør 50 mikroliter EDC sulfo-NHS-løsning umiddelbart på sensorbrikken.Dekk Petri parabolen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Aspirer EDC sulfo-NHS-løsningen fra brikken og påfør 50 mikroliter en-molar MES-buffer. Aspirer MES-bufferen og skyll brikken to ganger med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirer PBS fra brikken og legg til målmolekylet Hsp90. Dekk glass petriskålen og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Aspirer deretter løsningen som inneholder målmolekylet og skyll tre ganger med 50 mikroliter 1X PBS.Aspirer 1X PBS-løsningen fra brikken og tilsett 50 mikroliter av den slukkede ene løsningen. Dekk glass petriskålen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Aspirer slukke den ene løsningen fra brikken og tilsett 50 mikroliter av slukken to oppløsning.Dekk glass petriskålen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter aspirerer du slukke toløsningen fra brikken og skyller brikken fem ganger ved hjelp av 50 mikroliter 1X PBS og etterlater den siste PBS-dråpen på sensoren. Forbered analyttfortynningsserien for Cdc37 i ønsket konsentrasjonsområde.Design eksperimentet til å inkludere minst åtte forskjellige analyttkonsentrasjoner for å oppnå en pålitelig dissosiasjonskonstant, eller KD-verdi, og lag disse forskjellige fortynningene i samme buffer som brukes til kalibrering og målprotein. Plasser brikken forsiktig på instrumentet. Kontroller at programvaren er på og at LED-lyset lyser grønt.Trykk deretter på Kjør eksperiment-modulen på den automatiserte programvaren og velg 10 poeng med regenerering eller en hvilken som helst annen ønsket protokoll. Fyll ut detaljer som operatørnavn, eksperimentnavn, dato, regenereringsbuffer, immobilisert mål og analytten i løsningen. Trykk på Start eksperiment-knappen som vises på programvaren, og følg instruksjonene som vises av den automatiserte programvaren.For å utføre instrumentkalibreringen aspirerer du den gjenværende PBS-løsningen fra brikken og påfører 50 mikroliter av kalibreringsbufferen. Trykk på Fortsett-knappen og vent i fem minutter til kalibreringstrinnet er ferdig. Programvaren viser endepunktet som er bestemt for kalibreringstrinnet med en advarselsalarm å følge opp.Deretter utfører du en analyttforening ved å aspirere kalibreringsbufferen fra brikken og påføre 50 mikroliter med lavest analyttkonsentrasjon. Trykk på Fortsett-knappen og vent i fem minutter til tilknytningstrinnet er ferdig. Programvaren viser sluttpunktet for tilknytningstrinnet med en advarselsalarm for å fortsette.For å utføre en analyttdissosiasjon, aspirer analyttoppløsningen fra brikken og påfør 50 mikroliter av dissosiasjonsbufferen. Trykk på fortsett-knappen. Etter varigheten av dissosiasjonstrinnet viser programvaren endepunktet for dissosiasjonstrinnet med en advarselsalarm.Deretter utfører du brikkeregenerering ved å aspirere dissosiasjonsløsningen fra brikken og påføre 50 mikroliter av regenereringsbufferen. Trykk deretter på Fortsett-knappen. Regenereringstrinnet tar vanligvis omtrent 30 sekunder å fullføre.Etter det viser programvaren sluttpunktet for regenereringstrinnet med en advarselsalarm å følge opp. Til slutt, for å vaske brikken, aspirer regenereringsløsningen fra brikken og påfør 50 mikroliter av vaskebufferen. Aspirer løsningen fra brikken og gjenta dette fem ganger.La den siste dråpen av vaskebufferen ligge på brikken. Trykk deretter på Fortsett-knappen og vent i 30 sekunder til vasketrinnvarigheten er ferdig i programvaredisplayet. Gjenta trinnene for hver analyttkonsentrasjon som brukes.De fem trinnene i kalibrering, analyttforening, dissosiasjon, regenerering og vasking fem ganger utgjør en syklus. Trykk på Analyse-knappen i den automatiserte analyseprogramvaren på slutten av eksperimentet. Et visningsvindu som inneholder alle eksperimentelle punkter, vises.Forsikre deg om at analyttkonsentrasjonene som brukes til den foreskrevne protokollen er riktige. Trykk på Kjør analyse-knappen for å generere KD-verdien automatisk. Programvaren genererer en hill fit plott ved å plotte analyttkonsentrasjonene mot de tilsvarende I-responsene som dissosiasjonskonstanten ved likevekt beregnes fra.Målproteinet Hsp90 ble immobilisert til brikken, og for det første eksperimentet ble det utarbeidet 10 konsentrasjoner av analyttproteinet Cdc37 fra 25 nanomolars til 5000 nanomolars. Datafilene generert fra eksperiment en har blitt vist her. De eksperimentelle dataene som overvåkes i sanntid, vises her.Y-aksen tilsvarer I-responsen i biosensorenhetene, og X-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Det grafiske bildet som vises her representerer hill fit-plottet generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-responsen i biosensorenhetene, og X-aksen tilsvarer de forskjellige analyttkonsentrasjonene i eksperimentet.Det grafiske bildet som vises her representerer tilknytningsplottet som genereres ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-responsen på slutten av tilknytningsfasen, og X-aksen tilsvarer de forskjellige konsentrasjonene av analytten Cdc37. I eksperiment to ble et annet sett med konsentrasjoner fra 0,4 nanomolar til 200 nanomolar brukt, og de genererte datafilene vises her.De grafiske bildene representerer ITC-termogrammet for Hsp90- og Cdc37-interaksjon. Vist her er de tilsvarende varme-utviklende kurver oppnådd på grunn av påfølgende injeksjoner av Cdc37 i Hsp90 på 298.15 Kelvin. Differensialkraften som brukes her er en funksjon av tid.De integrerte datapunktene i dette plottet betegner den tilsvarende normaliserte varmen kontra Mueller-forholdet mellom Hsp90 og Cdc37. Den åpne pipetteringsmetoden som brukes her krever at brukeren har en grunnleggende mestring av håndpipettering, og sørger for ikke å berøre biosensoren med spissen. Reproduserbarheten av trinntimingen avhenger helt av brukeren.Når forskeren karakteriserer et samspill mellom to biomolekyler, kan vi utføre et screeningeksperiment ved å designe potensielle hemmere eller modulatorer rettet mot den spesifikke biomolekylære interaksjonen ved hjelp av FEB-systemet. Denne prosedyren kan brukes til å identifisere, verifisere og kvantifisere kjent og ny interaksjon mellom proteiner, samt små molekyler, inkludert narkotika og peptider.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...