Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Binational Science Foundation (BSF) para s.K.S. e N.Q.

NOTA: As proteínas recombinantes utilizadas neste estudo, Hsp90 e Cdc37, foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Ativação de chips
NOTA: Todos os materiais a serem utilizados no experimento estão listados na Tabela de Materiais. Filtre todas as soluções preparadas através de um filtro estéril de 0,2 μm.
<ol><li>Prepare a solução de carbodiimídeo de 1-Ethyl-3-3-(3-dimethylamino propyl...

Neste estudo, foi avaliada a viabilidade do uso da tecnologia FEB (abordagem de caracterização cinética em tempo real) para determinar a interação biomolecular entre Hsp90 e Cdc37. O experimento exploratório inicial (primeiro experimento) sugeriu que a escolha das concentrações adequadas de analito é uma parte crítica do experimento e que o experimento deve ser projetado por incluir pontos de concentração acima e abaixo do valor KD , que foram previstos com base nos dados disponíveis na literatura...

Interações biomoleculares: As proteínas são partes essenciais dos organismos e participam de inúmeras vias moleculares, como metabolismo celular, estrutura celular, sinalização celular, respostas imunes, adesão celular e muito mais. Enquanto algumas proteínas executam suas funções de forma independente, a maioria das proteínas interagem com outras proteínas usando uma interface de ligação para coordenar a atividade biológica adequada1.
As interações biomoleculares podem ser classificadas principalmente com base nas distintas características estruturais e funcionais das proteínas envolvidas2, por exemplo, com base nas superfícies proteicas, na estabilidade complexa ou na persistência das interações3. Identificar proteínas essenciais e seus papéis nas interações biomoleculares é vital para a compreensão de mecanismos bioquímicos no nível molecular4. Atualmente, existem várias abordagens para detectar essas interações5: in vitro6, no silico7, nas células vivas8, ex vivo9, e in vivo10 com cada um tendo seus próprios pontos fortes e fracos.
Os ensaios in vivo são realizados utilizando todo o animal como ferramenta experimental11, e os ensaiost he ex vivo são realizados em extratos de tecido ou órgãos inteiros (por exemplo, coração, cérebro, fígado) em um ambiente externo controlado, proporcionando alterações mínimas em condições naturais. A aplicação mais comum de estudos in vivo e ex vivo é avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e os efeitos de toxicidade de potenciais agentes farmacológicos antes dos testes em humanos, garantindo sua segurança e eficácia globais12.
Interações biomoleculares também podem ser detectadas dentro de células vivas. As células vivas de imagem nos permitem observar interações dinâmicas enquanto executam as reações de uma determinada via bioquímica13. Além disso, técnicas de detecção, como bioluminescência ou transferência de ressonância fluorescência, podem fornecer informações sobre onde e quando essas interações ocorrem dentro da célula14. Embora a detecção em células vivas ofereça detalhes cruciais, essas metodologias de detecção dependem de óptica e rótulos, que podem não refletir a biologia nativa; eles também são menos controlados do que os métodos in vitro e requerem especialização especializada para realizar15.
Os métodos computacionais em silico são usados principalmente para a triagem em larga escala de moléculas-alvo antes dos experimentos in vitro . Métodos de previsão computacional, bancos de dados baseados em computador, acoplamento molecular, relações de estrutura-atividade quantitativa e outras abordagens de simulação de dinâmica molecular estão entre os bem estabelecidos nas ferramentas silico 16. Em comparação com técnicas experimentais laboriosas, as ferramentas em silico podem facilmente fazer previsões com alta sensibilidade, mas com menor precisão no desempenho preditivo17.
Ensaios in vitro são realizados com microrganismos ou moléculas biológicas fora de seu contexto biológico padrão. Retratar interações biomoleculares através de métodos in vitro é fundamental para entender as funções proteicas e a biologia por trás da complexa rede de funcionamento celular. A metodologia de ensaio preferencial é escolhida de acordo com as propriedades intrínsecas da proteína, valores cinéticos e o modo e intensidade das interações18,19.
A interação Hsp90/Cdc37: A via acompanhante-quinase, que conecta Hsp90 e Cdc37, é um alvo terapêutico promissor na biologia tumoral20. O Hsp90 desempenha um papel central no controle do ciclo celular, montagem de proteínas, sobrevivência celular e caminhos de sinalização. Proteínas que dependem do Hsp90 para suas funções são entregues ao Hsp90 para complexação através de um co-acompanhante, como o Cdc37. O complexo Hsp90/Cdc37 controla a dobra da maioria das quinases proteicas e serve como um hub para uma infinidade de redes de sinalização intracelular21. É um alvo anti-tumor promissor devido à sua expressão elevada em várias malignidades, incluindo leucemia mieloblástica aguda, mieloma múltiplo e carcinoma hepatocelular22,23.
Comumente usadas técnicas de detecção de interação biomolecular in vitro A co-imunoprecipitação (co-IP) é uma técnica que depende da especificidade do anticorpo de antígeno para identificar interações biologicamente relevantes24. A principal desvantagem deste método é sua incapacidade de detectar interações de baixa afinidade e valores cinéticos24. Métodos biofísicos como calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon superficial (SPR), interferometria biocamida (BLI) e tecnologia FEB são preferidos para determinar os valores cinéticos.
ITC é um método de detecção biofísica baseado na determinação da energia vinculante, juntamente com uma análise termodinâmica completa para caracterizar interações biomoleculares25. A principal vantagem do ITC é que ele não requer nenhuma rotulagem ou fixação da proteína alvo. As principais dificuldades encontradas pelo ITC são a alta concentração de proteína-alvo necessária para um experimento e a dificuldade em analisar complexos não covalentes devido a pequenas indeseçõesde ligação 26. Tanto o SPR quanto o BLI são técnicas biofísicas sem rótulos que dependem da imobilização da molécula alvo na superfície do sensor, seguidas de injeções subsequentes do analito sobre o alvo imobilizado27,28. Em SPR, são medidas alterações no índice refrativo durante interações biomoleculares27; em BLI, a interferência na luz refletida é registrada em tempo real como uma mudança no comprimento de onda em função do tempo28. Tanto o SPR quanto o BLI compartilham vantagens comuns de oferecer altas especificidades, sensibilidade e recursos de detecção29. Em ambos os métodos, a proteína alvo é imobilizada em superfícies biosensoras e, portanto, pode haver alguma perda da conformação nativa do alvo, o que dificulta a discriminação entre interações específicas versus não específicas30. A BLI usa biosensores descartáveis de fibra óptica caros para imobilizar o alvo e, portanto, é uma técnicacara 31. Em comparação com essas ferramentas bem estabelecidas de detecção biomolecular, a tecnologia FEB oferece uma plataforma confiável e livre de rótulos usando baixas concentrações de nanomolar para detecção biomolecular em tempo real com caracterização cinética. A tecnologia FEB também supera os desafios borbulhantes enfrentados no ITC e é mais econômica em comparação com a SPR ou BLI.
O biosensores baseados em transistor de efeito de campo (FET) é um campo emergente para detectar interações biomoleculares, oferecendo aplicações biomédicas variadas. No sistema FET, os alvos são imobilizados para os chips biosensor e as interações são detectadas por alterações na condutância32. A característica única a ser considerada no desenvolvimento de um biosensor eletrônico eficiente são as propriedades físico-químicas, como a natureza semi-condutora e a estabilidade química do material de revestimento usado para fabricar a superfície do sensor33. Materiais convencionais como o silício usado para fet limitaram a sensibilidade dos sensores porque requer camadas de óxido entre o canal do transistor e um ambiente específico para o bom funcionamento34. Além disso, os transistores de silício são sensíveis a ambientes de alto sal, dificultando a mensuração das interações biológicas em seu ambiente natural. O biosensor à base de grafeno é apresentado como uma alternativa, pois oferece excelente estabilidade química e campo elétrico. Uma vez que o grafeno é uma única camada atômica de carbono, é extremamente sensível como um semicondutor e quimicamente compatível com soluções biológicas; ambas as qualidades são desejáveis para gerar biosensores eletrônicos compatíveis35. O notável potencial de carregamento ultra-alto de biomoléculas oferecido por biosensores revestidos de grafeno leva ao desenvolvimento da tecnologia FEB baseada em grafeno.
Princípio da tecnologia FEB: FEB é uma técnica de detecção biomolecular sem rótulos que mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. As interações entre a proteína imobilizada e o analito resultam em alterações na corrente que são monitoradas em tempo real, permitindo medições cinéticas precisas36.
Instrumentação: O sistema FEB compreende um chip de sensor transistor de efeito de campo de grafeno (gFET) e um leitor eletrônico que aplica uma tensão constante ao longo do experimento (Figura 1). O analito é aplicado em solução para a proteína alvo imobilizada na superfície do biosensor. Quando ocorre uma interação, uma alteração na corrente é medida e registrada em tempo real. À medida que a concentração de analito aumenta, a fração de analito ligado também aumentará, causando maiores alterações na correnteza. Utilizando o software de análise automatizada fornecido com o instrumento (Tabela de Materiais), o I-Response é medido e registrado em termos de unidades de biosensação (BU)37. A I-Resposta é definida como a alteração na corrente (I) através do chip biosensor medido em tempo real após a interação do alvo imobilizado com o analito. O software de análise automatizada FEB pode analisar tanto o I-Response quanto o C-Response para eventos de interação dinâmica, onde o C-Response registra as alterações na capacitância (C). As variações tanto na I-Resposta quanto na Resposta C correspondem diretamente à fração de analito vinculado e podem ser analisadas para gerar valores KD . A preferência padrão do software de análise automatizada é I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral da configuração experimental. (A) chip baseado em grafeno e um leitor eletrônico. (B) Uma visão geral dos componentes do chip. O chip está ligado a dois eletrodos que fornecem corrente ao sistema. A superfície do chip é coberta com grafeno, que quando ativado pode ligar o alvo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Metodologia: Inicialmente, o chip biosensor ativado é inserido no dispositivo FEB (Figura 1) seguido da execução das etapas abaixo: (1) Calibração: O experimento começa com a calibração do sistema usando 1x salina tamponada de fosfato (PBS; pH = 7,4) para criar a resposta de equilíbrio de linha de base. (2) Associação: O analito é introduzido no chip e o I-Response é monitorado até que a saturação de vinculação seja alcançada. (3) Dissociação: O analito é dissociado utilizando 1x PBS. (4) Regeneração: Os remanescentes do analito são removidos utilizando-se 1x PBS. (5) Lavagem: Um total de cinco lavagens são realizadas utilizando 1x PBS para a remoção completa dos analitos amarrados e desvinculados do chip.
Análise: A análise de dados é realizada utilizando-se o software totalmente automatizado fornecido com o instrumento. O software de análise automatizada gera um gráfico de ajuste hill com um valor KD . O enredo de ajuste de Hill descreve a associação de um analito à proteína alvo em função de concentrações de analitos. A concentração na qual uma resposta semi-máxima é alcançada é proporcional ao valor KD . Um baixo valor KD representa alta afinidade vinculante e vice-versa.
Para validar os dados obtidos a partir do experimento FEB, as Respostas I são extraídas de cada ponto de leitura para cada concentração de analitos usando o software de revisão/exportação de dados e podem ser exportadas para outros softwares de análise estatística (ver Tabela de Materiais), conforme explicado abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

As interações biomoleculares desempenham papéis versáteis em inúmeros processos celulares, regulando e coordenando eventos biológicos funcionalmente relevantes. Biomoléculas como proteínas, carboidratos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos e enzimas são blocos fundamentais de construção de seres vivos; eles se reúnem em redes complexas em biossistemas para sincronizar uma miríade de eventos de vida. As proteínas normalmente utilizam redes interativas complexas para realizar suas funções; por isso é obrigatório avaliar tais interações para desvendar sua importância nas células tanto em níveis celulares quanto de organismos. Em direção a esse objetivo, introduzimos uma tecnologia emergente em rápida inovação, biosensação de efeito de campo (FEB), para determinar interações biomoleculares específicas. FEB é uma técnica de detecção biomolecular sem rótulos e confiável para determinar interações específicas e usa biosensores de alta qualidade à base de eletrônicos. A tecnologia FEB pode monitorar interações na faixa de nanomolar devido aos nanomateriais biocompatíveis usados em sua superfície biosensor. Como prova de conceito, elucidada a interação proteína-proteína (PPI) entre a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) e o ciclo de divisão celular 37 (Cdc37). Hsp90 é um acompanhante molecular dependente de ATP que desempenha um papel essencial no controle de dobra, estabilidade, maturação e qualidade de muitas proteínas, regulando assim múltiplas funções celulares vitais. O Cdc37 é considerado um acompanhante molecular específico da quinase, pois reconhece e recruta especificamente quinases proteicas para Hsp90 para regular suas vias de transdução de sinal a jusante. Como tal, o Cdc37 é considerado co-acompanhante do Hsp90. A via acompanhante-quinase (complexo Hsp90/Cdc37) é hiperativada em múltiplas malignidades que promovem o crescimento celular; portanto, é um alvo potencial para a terapia do câncer. O presente estudo demonstra a eficiência da tecnologia FEB utilizando o sistema modelo Hsp90/Cdc37. A FEB detectou um PPI forte entre as duas proteínas (valores KD de 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM em três experimentos independentes). Em resumo, a FEB é uma plataforma de detecção de PPI sem rótulos e econômica, que oferece medições rápidas e precisas.

Resultados do experimento 1: A proteína alvo Hsp90 (500 nM) foi imobilizada para o chip seguindo o protocolo de imobilização de alvo, conforme descrito acima. Para o primeiro experimento, foram elaboradas 10 concentrações da proteína analito, Cdc37, variando de 25 nM a 5.000 nM, com base nos dados disponíveis na literatura (ver Tabela 1).
As etapas do experimento podem ser monitoradas em tempo real, seguindo as alterações ocorridas na I-Resposta (<...

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Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

A biosensação de efeito de campo (FEB) é uma técnica livre de rótulos para detectar interações biomoleculares. Ele mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. A tecnologia FEB foi utilizada para avaliar interações biomoleculares entre Hsp90 e Cdc37 e foi detectada uma forte interação entre as duas proteínas.

Explorando a interação biomolecular entre a acompanhante molecular Hsp90 e sua proteína cliente Kinase Cdc37 usando tecnologia de biosensão de efeito de campo

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB é uma plataforma de detecção de interação ________ Este método oferece validação de interações conhecidas ou desconhecidas e uma maneira fácil de testar para potenciais inibidores das interações biomoleculares. A principal vantagem da FEB é seu software automatizado e fácil de usar que emissa ao usuário durante todo o experimento com plataforma de pipetação aberta e manual, permitindo que os usuários trabalhem com pouco ou mesmo nenhum treinamento.A tecnologia FEB também oferece aplicações em diversos campos de fármacos, análise biomolecular de pequenas moléculas, peptídeos e proteínas, validação de medicamentos traduzindo a atividade biológica in vitro prontamente para a eficácia in vivo. Sendo um iniciante, você pode enfrentar desafios na escolha das concentrações de analito certos para otimizar o experimento para obter um valor KD confiável. Aconselhamos dar atenção ao processo de funcionalização do chip e à troca de buffer adequada.Comece misturando volumes iguais de solução EDC e sulfo-NHS por pipetting para cima e para baixo. Coloque o chip biosensor fornecido pela empresa em uma placa de vidro Petri com uma tampa equipada. Todas as etapas de funcionalização envolvidas na ativação do chip são sugeridas para serem feitas dentro da placa de Petri.Aplique 50 microliters de tampão MES de um molar no chip biosensor. Incubar por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o buffer e aplique 50 microliters da solução EDC sulfo-NHS imediatamente ao chip do sensor.Cubra a placa de Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução EDC sulfo-NHS do chip e aplique 50 microliters de buffer MES de um molar. Aspire o buffer MES e enxágue o chip duas vezes com 50 microliters de 1X PBS.Aspire o PBS do chip e adicione a molécula alvo Hsp90. Cubra a placa de petri de vidro e incuba por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução contendo a molécula alvo e enxágue três vezes com 50 microliters de 1X PBS.Aspire a solução 1X PBS do chip e adicione 50 microliters da solução de saciar uma. Cubra a placa de vidro Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a saciar uma solução do chip e adicionar 50 microliters da solução de saciar duas.Cubra a placa de vidro Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, aspire a solução de duas saídas do chip e enxágue o chip cinco vezes usando 50 microliters de 1X PBS deixando a última gotícula PBS no sensor. Prepare a série de diluição de analito para Cdc37 na faixa de concentração desejada.Projete o experimento para incluir pelo menos oito concentrações diferentes de analito para obter uma constante de dissociação confiável, ou valor KD, e prepare essas diferentes diluições no mesmo buffer usado para calibração e proteína-alvo. Coloque o chip cuidadosamente no instrumento. Certifique-se de que o software está ligado e a luz LED fica verde.Em seguida, pressione o módulo Executar Experimento no software automatizado e escolha 10 pontos com regeneração ou qualquer outro protocolo desejado. Preencha os detalhes como nome do operador, nome do experimento, data, buffer de regeneração, alvo imobilizado e o analito na solução. Pressione o botão Iniciar Experimento exibido no software e siga as instruções mostradas pelo software automatizado.Para realizar a calibração do instrumento, aspire a solução PBS restante do chip e aplique 50 microliters do buffer de calibração. Pressione o botão Continuar e aguarde por cinco minutos até que a etapa de calibração esteja concluída. O software exibe o ponto final determinado para a etapa de calibração com um alarme de aviso para acompanhar.Em seguida, realize uma associação de analitos aspirando o tampão de calibração do chip e aplicando 50 microliters da menor concentração de analito. Pressione o botão Continuar e aguarde por cinco minutos até que a etapa de associação esteja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de associação com um alarme de aviso para prosseguir.Para realizar uma dissociação de analito, aspire a solução de analito do chip e aplique 50 microliters do tampão de dissociação. Pressione o botão continuar. Após a duração da etapa de dissociação, o software exibe o ponto final para a etapa de dissociação com um alarme de aviso.Em seguida, realize a regeneração do chip aspirando a solução de dissociação do chip e aplicando 50 microliters do buffer de regeneração. Em seguida, pressione o botão Continuar. A etapa de regeneração normalmente leva aproximadamente 30 segundos para terminar.Depois disso, o software exibe o ponto final para a etapa de regeneração com um alarme de aviso para acompanhar. Por fim, para lavar o chip, aspire a solução de regeneração do chip e aplique 50 microliters do tampão de lavagem. Aspire a solução do chip e repita isso cinco vezes.Deixe a última gota do tampão de lavagem no chip. Em seguida, pressione o botão Continuar e aguarde por 30 segundos até que a duração da etapa de lavagem seja concluída no visor do software. Repita os passos para cada concentração de analito utilizada.Os cinco passos da calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem cinco vezes constituem um ciclo. Pressione o botão Análise no software de análise automatizada no final do experimento. Uma janela de exibição contendo todos os pontos experimentais aparecerá.Certifique-se de que as concentrações de analito utilizadas para o protocolo prescrito estão corretas. Pressione o botão Análise de execução para gerar o valor KD automaticamente. O software gera um gráfico de ajuste de colina, plotando as concentrações de analitos contra as respostas I correspondentes das quais a constante de dissociação no equilíbrio é calculada.A proteína alvo Hsp90 foi imobilizada para o chip, e para o primeiro experimento, foram preparadas 10 concentrações da proteína analito Cdc37 variando de 25 nanomolars a 5.000 nanomolars. Os arquivos de dados gerados a partir do experimento um foi mostrado aqui. Os dados experimentais monitorados em tempo real são mostrados aqui.O eixo Y corresponde à resposta I nas unidades biosensoras, e o eixo X corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. A imagem gráfica mostrada aqui representa o gráfico hill fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo Y corresponde à resposta I nas unidades biosensoras, e o eixo X corresponde às diferentes concentrações de analito no experimento.A imagem gráfica aqui mostrada representa o enredo de associação gerado utilizando o software de análise estatística. O eixo Y corresponde à resposta I no final da fase de associação, e o eixo X corresponde às diferentes concentrações do analito Cdc37. No experimento dois, foi utilizado um conjunto diferente de concentrações que variam de 0,4 nanomolar a 200 nanomolar, e os arquivos de dados gerados são mostrados aqui.As imagens gráficas representam o termograma ITC da interação Hsp90 e Cdc37. Aqui são mostradas as curvas correspondentes de evolução do calor obtidas devido às injeções consecutivas de Cdc37 em Hsp90 a 298,15 Kelvin. O poder diferencial usado aqui é uma função do tempo.Os pontos de dados integrados nesta trama designam o calor normalizado correspondente versus a razão Mueller de Hsp90 a Cdc37. A abordagem de pipetação aberta utilizada aqui requer que o usuário tenha um domínio básico da pipetação manual, certificando-se de não tocar no biosensor com a ponta. A reprodutibilidade do tempo de etapa depende inteiramente do usuário.Uma vez que o pesquisador caracterize uma interação entre duas biomoléculas, podemos realizar um experimento de triagem projetando potenciais inibidores ou moduladores visando a interação biomolecular específica usando o sistema FEB. Este procedimento pode ser usado para identificar, verificar e quantificar a interação conhecida e nova entre proteínas, bem como pequenas moléculas, incluindo drogas e peptídeos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Triagem Estratégica e Caracterização do Complexo de Sinalização de Proteínas Visuais GPCR-mini-G para cristalização bem sucedida

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...