Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Biational Science Foundation (BSF) a S.K.S. y N.Q.

NOTA: Las proteínas recombinantes utilizadas en este estudio, Hsp90 y Cdc37, se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).
1. Activación del chip
NOTA: Todos los materiales que se utilizarán en el experimento se enumeran en la Tabla de materiales. Filtre todas las soluciones preparadas a través de un filtro estéril de 0,2 μm.
<ol><li>Preparar la solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodii...

En este estudio, se evaluó la viabilidad de utilizar la tecnología FEB (un enfoque de caracterización cinética en tiempo real) para determinar la interacción biomolecular entre Hsp90 y Cdc37. El experimento exploratorio inicial (primer experimento) sugirió que la elección de las concentraciones adecuadas de analito es una parte crítica del experimento y que el experimento debería diseñarse incluyendo puntos de concentración por encima y por debajo del valor de KD , que se predijeron en función de l...

Interacciones biomoleculares: Las proteínas son partes esenciales de los organismos y participan en numerosas vías moleculares como el metabolismo celular, la estructura celular, la señalización celular, las respuestas inmunes, la adhesión celular y más. Mientras que algunas proteínas realizan su(s) función(es) de forma independiente, la mayoría de las proteínas interactúan con otras proteínas utilizando una interfaz de unión para coordinar la actividad biológica adecuada1.
Las interacciones biomoleculares se pueden clasificar principalmente en función de las distintas características estructurales y funcionales de las proteínas involucradas2, por ejemplo, en función de las superficies de las proteínas, la estabilidad compleja o la persistencia de las interacciones3. La identificación de proteínas esenciales y su papel en las interacciones biomoleculares es vital para comprender los mecanismos bioquímicos a nivel molecular4. Actualmente, existen varios enfoques para detectar estas interacciones5: in vitro6, in silico7, en células vivas8, ex vivo9 e in vivo10, cada una con sus propias fortalezas y debilidades.
Los ensayos in vivo se realizan utilizando todo el animal como herramienta experimental11, ylos ensayos ex vivo se realizan en extractos de tejidos u órganos enteros (por ejemplo, corazón, cerebro, hígado) en un entorno externo controlado proporcionando alteraciones mínimas en condiciones naturales. La aplicación más común de los estudios in vivo y ex vivo es evaluar los efectos farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicidad de los posibles agentes farmacológicos antes de los ensayos en humanos garantizando su seguridad y eficaciagenerales 12.
Las interacciones biomoleculares también se pueden detectar dentro de las células vivas. Las imágenes de células vivas nos permiten observar interacciones dinámicas a medida que ejecutan las reacciones de una vía bioquímica particular13. Además, las técnicas de detección, como la bioluminiscencia o la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, pueden proporcionar información sobre dónde y cuándo ocurren estas interacciones dentro de la célula14. Aunque la detección en células vivas ofrece detalles cruciales, estas metodologías de detección se basan en ópticas y etiquetas, que pueden no reflejar la biología nativa; también están menos controlados que los métodos in vitro y requieren experiencia especializada para realizar15.
Los métodos computacionales in silico se utilizan principalmente para el cribado a gran escala de moléculas diana antes de los experimentos in vitro . Los métodos de predicción computacional, las bases de datos basadas en computadora, el acoplamiento molecular, las relaciones cuantitativas estructura-actividad y otros enfoques de simulación de dinámica molecular se encuentran entre las herramientas in silico bien establecidas16. En comparación con las laboriosas técnicas experimentales, las herramientas in silico pueden hacer predicciones fácilmente con alta sensibilidad, pero con una precisión reducida en el rendimiento predictivo17.
Los ensayos in vitro se realizan con microorganismos o moléculas biológicas fuera de su contexto biológico estándar. Retratar las interacciones biomoleculares a través de métodos in vitro es fundamental para comprender las funciones de las proteínas y la biología detrás de la compleja red de funcionamiento celular. La metodología de ensayo preferida se elige de acuerdo con las propiedades intrínsecas de la proteína, los valores cinéticos y el modo e intensidad de las interacciones18,19.
La interacción Hsp90/Cdc37: La vía chaperona-quinasa, que conecta Hsp90 y Cdc37, es una diana terapéutica prometedora en biología tumoral20. Hsp90 desempeña un papel central en el control del ciclo celular, el ensamblaje de proteínas, la supervivencia celular y las vías de señalización. Las proteínas que dependen de Hsp90 para sus funciones se entregan a Hsp90 para su complejación a través de una co-chaperona, como Cdc37. El complejo Hsp90/Cdc37 controla el plegamiento de la mayoría de las proteínas quinasas y sirve como centro para una multitud de redes de señalización intracelular21. Es una diana antitumoral prometedora debido a su elevada expresión en diversas neoplasias malignas, incluyendo leucemia mieloblástica aguda, mieloma múltiple y carcinoma hepatocelular22,23.
Técnicas de detección de interacción biomolecular in vitro de uso común La coinmunoprecipitación (co-IP) es una técnica que se basa en la especificidad antígeno-anticuerpo para identificar interacciones biológicamente relevantes24. La principal desventaja de este método es su incapacidad para detectar interacciones de baja afinidad y valores cinéticos24. Se prefieren métodos biofísicos como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la resonancia de plasmón de superficie (SPR), la interferometría de biocapa (BLI) y la tecnología FEB para determinar los valores cinéticos.
ItC es un método de detección biofísica basado en la determinación de la energía de unión junto con un análisis termodinámico completo para caracterizar las interacciones biomoleculares25. La principal ventaja de ITC es que no requiere ningún etiquetado o fijación de la proteína objetivo. Las principales dificultades encontradas por el ITC son la alta concentración de proteína objetivo requerida para un experimento y la dificultad para analizar complejos no covalentes debido a pequeñas entalpías de unión26. Tanto SPR como BLI son técnicas biofísicas sin etiquetas que se basan en la inmovilización de la molécula diana en la superficie del sensor, seguida de inyecciones posteriores del analito sobre el objetivo inmovilizado27,28. En SPR se miden alteraciones en el índice de refracción durante las interacciones biomoleculares27; en BLI, la interferencia en la luz reflejada se registra en tiempo real como un cambio en la longitud de onda en función del tiempo28. Tanto SPR como BLI comparten ventajas comunes de ofrecer capacidades de alta especificidad, sensibilidad y detección29. En ambos métodos, la proteína diana se inmoviliza en las superficies de los biosensores y, por lo tanto, puede haber cierta pérdida de la conformación nativa del objetivo, lo que dificulta la discriminación entre interacciones específicas vs. no específicas30. BLI utiliza costosos biosensores desechables de fibra óptica para inmovilizar el objetivo y, por lo tanto, es una técnica costosa31. En comparación con estas herramientas de detección biomolecular bien establecidas, la tecnología FEB ofrece una plataforma confiable y libre de etiquetas mediante el uso de bajas concentraciones nanomolares para la detección biomolecular en tiempo real con caracterización cinética. La tecnología FEB también supera los burbujeantes desafíos que enfrenta el ITC y es más rentable en comparación con SPR o BLI.
Los biosensores basados en transistores de efecto de campo (FET) son un campo emergente para detectar interacciones biomoleculares al ofrecer diversas aplicaciones biomédicas. En el sistema FET, los objetivos se inmovilizan a los chips del biosensor y las interacciones se detectan mediante cambios en la conductancia32. La característica única a considerar en el desarrollo de un biosensor electrónico eficiente son las propiedades fisicoquímicas como la naturaleza semiconductora y la estabilidad química del material de recubrimiento utilizado para fabricar la superficie del sensor33. Los materiales convencionales como el silicio utilizado para FET han limitado la sensibilidad de los sensores porque requiere capas de óxido intercaladas entre el canal del transistor y un entorno específico para un funcionamiento adecuado34. Además, los transistores de silicio son sensibles a ambientes con alto contenido de sal, lo que dificulta la medición de las interacciones biológicas en su entorno natural. El biosensor basado en grafeno se presenta como una alternativa, ya que ofrece una excelente estabilidad química y campo eléctrico. Dado que el grafeno es una sola capa atómica de carbono, es extremadamente sensible como semiconductor y químicamente compatible con soluciones biológicas; ambas cualidades son deseables para generar biosensores electrónicos compatibles35. El notable potencial de carga ultra alta de las biomoléculas ofrecidas por los biosensores recubiertos de grafeno conduce al desarrollo de la tecnología FEB de biosensores basados en grafeno.
Principio de la tecnología FEB: FEB es una técnica de detección biomolecular sin etiqueta que mide la corriente eléctrica a través del biosensor de grafeno al que se inmovilizan los objetivos de unión. Las interacciones entre la proteína inmovilizada y el analito dan lugar a alteraciones en la corriente que se monitorizan en tiempo real, lo que permite mediciones cinéticas precisas36.
Instrumentación: El sistema FEB comprende un chip sensor de transistor de efecto de campo de grafeno (gFET) y un lector electrónico que aplica un voltaje constante durante todo el experimento (Figura 1). El analito se aplica en solución a la proteína diana inmovilizada en la superficie del biosensor. Cuando se produce una interacción, se mide y registra una alteración en la corriente en tiempo real. A medida que aumenta la concentración de analitos, la fracción de analito unido también aumentará, causando mayores alteraciones en la corriente. Utilizando el software de análisis automatizado proporcionado con el instrumento (Tabla de Materiales), I-Response se mide y registra en términos de unidades de biodetección (BU)37. I-Response se define como la alteración en la corriente (I) a través del chip biosensor medida en tiempo real sobre la interacción del objetivo inmovilizado con el analito. El software de análisis automatizado FEB puede analizar tanto la I-Response como la C-Response a eventos de interacción dinámica, donde la C-Response registra las alteraciones en la capacitancia (C). Las variaciones tanto en la I-Response como en la C-Response corresponden directamente a la fracción de analito unido y pueden analizarse más a fondo para generar valores KD . La preferencia predeterminada del software de análisis automatizado es I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de la configuración experimental. (A) Chip basado en grafeno y un lector electrónico. (B) Una visión general de los componentes del chip. El chip está unido a dos electrodos que suministran corriente al sistema. La superficie del chip está cubierta con grafeno, que cuando se activa puede unir al objetivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Metodología: Inicialmente, el chip biosensor activado se inserta en el dispositivo FEB (Figura 1) seguido de la ejecución de los pasos descritos a continuación: (1) Calibración: El experimento comienza con la calibración del sistema utilizando 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH = 7.4) para crear la respuesta de equilibrio basal. (2) Asociación: El analito se introduce en el chip, y el I-Response se monitorea hasta que se alcanza la saturación de unión. (3) Disociación: El analito se disocia usando 1x PBS. (4) Regeneración: Los restos del analito se eliminan usando 1x PBS. (5) Lavado: Se realizan un total de cinco lavados utilizando 1x PBS para la eliminación completa de los analitos unidos y no unidos del chip.
Análisis: El análisis de datos se realiza utilizando el software totalmente automatizado proporcionado con el instrumento. El software de análisis automatizado genera un diagrama de ajuste de Hill con un valor KD . La gráfica de ajuste de Hill describe la asociación de un analito a la proteína objetivo en función de las concentraciones de analitos. La concentración a la que se alcanza una respuesta medio máxima es proporcional al valor KD . Un valor bajo de KD representa una alta afinidad de unión y viceversa.
Para validar los datos obtenidos del experimento FEB, las respuestas I se extraen de cada punto de lectura para cada concentración de analito utilizando el software de revisión / exportación de datos y se pueden exportar a otro software de análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales) como se explica a continuación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Las interacciones biomoleculares desempeñan un papel versátil en numerosos procesos celulares al regular y coordinar eventos biológicos funcionalmente relevantes. Las biomoléculas como proteínas, carbohidratos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos y enzimas son componentes fundamentales de los seres vivos; se ensamblan en redes complejas en biosistemas para sincronizar una miríada de eventos de la vida. Las proteínas suelen utilizar redes complejas de interactomas para llevar a cabo sus funciones; por lo tanto, es obligatorio evaluar tales interacciones para desentrañar su importancia en las células tanto a nivel celular como de organismo. Hacia este objetivo, introducimos una tecnología rápidamente emergente, la biodetección de efecto de campo (FEB), para determinar interacciones biomoleculares específicas. FEB es una técnica de detección biomolecular confiable y de sobremesa, sin etiquetas para determinar interacciones específicas y utiliza biosensores electrónicos de alta calidad. La tecnología FEB puede monitorear las interacciones en el rango nanomolar debido a los nanomateriales biocompatibles utilizados en su superficie de biosensor. Como prueba de concepto, se dilucidó la interacción proteína-proteína (PPI) entre la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) y el ciclo de división celular 37 (Cdc37). Hsp90 es una chaperona molecular dependiente de ATP que desempeña un papel esencial en el plegamiento, la estabilidad, la maduración y el control de calidad de muchas proteínas, regulando así múltiples funciones celulares vitales. Cdc37 se considera una chaperona molecular específica de la proteína quinasa, ya que reconoce y recluta específicamente proteínas quinasas para Hsp90 para regular sus vías de transducción de señales aguas abajo. Como tal, Cdc37 se considera un co-chaperone de Hsp90. La vía chaperona-quinasa (complejo Hsp90/Cdc37) está hiperactivada en múltiples neoplasias malignas que promueven el crecimiento celular; por lo tanto, es un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer. El presente estudio demuestra la eficiencia de la tecnología FEB utilizando el sistema modelo Hsp90/Cdc37. FEB detectó un fuerte PPI entre las dos proteínas (valores de KD de 0,014 μM, 0,053 μM y 0,072 μM en tres experimentos independientes). En resumen, FEB es una plataforma de detección de PPI sin etiquetas y rentable, que ofrece mediciones rápidas y precisas.

Resultados del experimento 1: La proteína diana Hsp90 (500 nM) se inmovilizó en el chip siguiendo el protocolo de inmovilización objetivo descrito anteriormente. Para el primer experimento, se prepararon 10 concentraciones de la proteína analito, Cdc37, que van desde 25 nM a 5.000 nM, en base a los datos disponibles en la literatura (ver Tabla 1).
Los pasos del experimento pueden ser monitoreados en tiempo real siguiendo las alteraciones que ocurren en ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

La biodetección de efectos de campo (FEB) es una técnica sin etiquetas para detectar interacciones biomoleculares. Mide la corriente eléctrica a través del biosensor de grafeno al que se inmovilizan los objetivos de unión. Se utilizó la tecnología FEB para evaluar las interacciones biomoleculares entre Hsp90 y Cdc37 y se detectó una fuerte interacción entre las dos proteínas.

Explorando la interacción biomolecular entre la chaperona molecular Hsp90 y su proteína quinasa cliente Cdc37 utilizando tecnología de biodetección de efecto de campo

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB es una plataforma de detección de interacción ______ ________ sin etiquetas y rentable que ofrece mediciones rápidas y precisas. Este método ofrece validación de interacciones conocidas o desconocidas y una manera fácil de probar posibles inhibidores de las interacciones biomoleculares. La principal ventaja de FEB es su software automatizado y fácil de usar que guía al usuario durante todo el experimento con una plataforma de pipeteo abierta y manual, lo que permite a los usuarios trabajar con poca o incluso ninguna capacitación.La tecnología FEB también ofrece aplicaciones en diversos campos de productos farmacéuticos, análisis biomolecular de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas, validación de medicamentos al traducir fácilmente la actividad biológica in vitro en eficacia in vivo. Al ser un principiante, puede enfrentar desafíos al elegir las concentraciones de analitos correctas para optimizar el experimento y obtener un valor de KD confiable. Aconsejamos prestar atención al proceso de funcionalización del chip y al intercambio de búfer adecuado.Comience mezclando volúmenes iguales de EDC y solución sulfo-NHS mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Coloque el chip biosensor suministrado por la empresa en una placa de Petri de vidrio con una tapa ajustada. Se sugiere que todos los pasos de funcionalización involucrados en la activación del chip se realicen dentro de la placa de Petri.Aplique 50 microlitros de tampón MES de un molar al chip biosensor. Incubar durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, aspire el búfer y aplique 50 microlitros de solución EDC sulfo-NHS inmediatamente al chip del sensor.Cubra la placa de Petri e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución EDC sulfo-NHS del chip y aplique 50 microlitros de tampón MES de un molar. Aspire el tampón MES y enjuague el chip dos veces con 50 microlitros de 1X PBS.Aspire el PBS del chip y agregue la molécula objetivo Hsp90. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire la solución que contiene la molécula objetivo y enjuague tres veces con 50 microlitros de 1X PBS.Aspire la solución 1X PBS del chip y agregue 50 microlitros de la solución de enfriamiento. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de enfriamiento de una solución del chip y agregue 50 microlitros de la solución de enfriamiento de dos.Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, aspire la solución de enfriamiento dos del chip y enjuague el chip cinco veces usando 50 microlitros de 1X PBS dejando la última gota de PBS en el sensor. Prepare la serie de dilución de analitos para Cdc37 en el rango de concentración deseado.Diseñe el experimento para incluir al menos ocho concentraciones diferentes de analitos para obtener una constante de disociación confiable, o valor KD, y prepare estas diferentes diluciones en el mismo tampón utilizado para la calibración y la proteína objetivo. Coloque el chip con cuidado en el instrumento. Asegúrese de que el software esté encendido y que la luz LED se vuelva verde.A continuación, presione el módulo Ejecutar experimento en el software automatizado y elija 10 puntos con regeneración o cualquier otro protocolo deseado. Complete los detalles como el nombre del operador, el nombre del experimento, la fecha, el búfer de regeneración, el objetivo inmovilizado y el analito en solución. Presione el botón Iniciar experimento que se muestra en el software y siga las instrucciones que muestra el software automatizado.Para realizar la calibración del instrumento, aspire la solución PBS restante del chip y aplique 50 microlitros del búfer de calibración. Pulse el botón Continuar y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de calibración. El software muestra el punto final determinado para el paso de calibración con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento.A continuación, realice una asociación de analitos aspirando el tampón de calibración del chip y aplicando 50 microlitros de la concentración de analito más baja. Pulse el botón Continuar y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de asociación. El software muestra el punto final para el paso de asociación con una alarma de advertencia para continuar.Para realizar una disociación de analito, aspire la solución de analito del chip y aplique 50 microlitros del tampón de disociación. Pulse el botón continuar. Después de la duración del paso de disociación, el software muestra el punto final para el paso de disociación con una alarma de advertencia.A continuación, realice la regeneración del chip aspirando la solución de disociación del chip y aplicando 50 microlitros del tampón de regeneración. Luego, presione el botón Continuar. El paso de regeneración suele tardar aproximadamente 30 segundos en finalizar.Después de eso, el software muestra el punto final para el paso de regeneración con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento. Finalmente, para lavar el chip, aspire la solución de regeneración del chip y aplique 50 microlitros del tampón de lavado. Aspire la solución del chip y repita esto cinco veces.Deje la última gota del tampón de lavado en el chip. Luego, presione el botón Continuar y espere 30 segundos hasta que finalice la duración del paso de lavado en la pantalla del software. Repita los pasos para cada concentración de analito utilizada.Los cinco pasos de la calibración, la asociación del analito, la disociación, la regeneración y el lavado cinco veces constituyen un ciclo. Pulse el botón Análisis en el software de análisis automatizado al final del experimento. Aparecerá una ventana de visualización que contiene todos los puntos experimentales.Asegúrese de que las concentraciones de analito utilizadas para el protocolo prescrito sean correctas. Pulse el botón Ejecutar análisis para generar el valor KD automáticamente. El software genera una gráfica de ajuste de colinas trazando las concentraciones de analitos contra las respuestas I correspondientes a partir de las cuales se calcula la constante de disociación en equilibrio.La proteína diana Hsp90 se inmovilizó al chip, y para el primer experimento, se prepararon 10 concentraciones de la proteína de analito Cdc37 que van desde 25 nanomolares hasta 5.000 nanomolares. Los archivos de datos generados a partir del experimento uno se han mostrado aquí. Los datos experimentales monitoreados en tiempo real se muestran aquí.El eje Y corresponde a la respuesta I en las unidades biosensoras, y el eje X corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. La imagen gráfica que se muestra aquí representa la gráfica de ajuste de colina generada a partir del software de análisis automatizado. El eje Y corresponde a la respuesta I en las unidades biosensoras, y el eje X corresponde a las diferentes concentraciones de analitos en el experimento.La imagen gráfica que se muestra aquí representa la gráfica de asociación generada utilizando el software de análisis estadístico. El eje Y corresponde a la respuesta I al final de la fase de asociación, y el eje X corresponde a las diferentes concentraciones del analito Cdc37. En el experimento dos, se utilizó un conjunto diferente de concentraciones que van desde 0,4 nanomolares hasta 200 nanomolares, y los archivos de datos generados se muestran aquí.Las imágenes gráficas representan el termograma ITC de la interacción Hsp90 y Cdc37. Aquí se muestran las curvas correspondientes de evolución del calor obtenidas debido a las inyecciones consecutivas de Cdc37 en Hsp90 a 298.15 Kelvin. La potencia diferencial utilizada aquí es una función del tiempo.Los puntos de datos integrados en esta gráfica designan el calor normalizado correspondiente frente a la relación de Mueller de Hsp90 a Cdc37. El enfoque de pipeteo abierto utilizado aquí requiere que el usuario tenga un dominio básico del pipeteo manual, asegurándose de no tocar el biosensor con la punta. La reproducibilidad del tiempo de paso depende completamente del usuario.Una vez que el investigador caracteriza una interacción entre dos biomoléculas, podemos realizar un experimento de cribado mediante el diseño de inhibidores o moduladores potenciales dirigidos a la interacción biomolecular específica utilizando el sistema FEB. Este procedimiento se puede utilizar para identificar, verificar y cuantificar la interacción conocida y novedosa entre proteínas, así como moléculas pequeñas, incluidos medicamentos y péptidos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Examen estratégico y caracterización del complejo de señalización de proteínas Visual GPCR-mini-G para una cristalización exitosa

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...