Name: exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Bu araştırma, İki Uluslu Bilim Vakfı'ndan (BSF) S.K.S. ve N.Q.'ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

NOT: Bu çalışmada kullanılan rekombinant proteinler, Hsp90 ve Cdc37, ticari olarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Çip aktivasyonu
NOT: Deneyde kullanılacak tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Hazırlanan tüm çözeltileri steril 0,2 μm filtreden süzün.
<ol><li>15 mL'lik bir tüpte 2.5 mL'lik 1 M 2-(N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) tamponuna (pH = 6.0) 2 mg EDC ekle...

Bu çalışmada, Hsp90 ve Cdc37 arasındaki biyomoleküler etkileşimi belirlemek için FEB teknolojisinin (gerçek zamanlı kinetik karakterizasyon yaklaşımı) kullanılmasının fizibilitesi değerlendirilmiştir. İlk keşif deneyi (ilk deney), uygun analit konsantrasyonlarının seçilmesinin deneyin kritik bir parçası olduğunu ve deneyin, literatürde bulunan verilere dayanarak tahmin edilen KD değerinin üstünde ve altında konsantrasyon noktaları dahil edilerek tasarlanması gerektiğini öne s?...

Biyomoleküler etkileşimler: Proteinler organizmaların temel parçalarıdır ve hücre metabolizması, hücre yapısı, hücre sinyalizasyonu, bağışıklık tepkileri, hücre yapışması ve daha fazlası gibi çok sayıda moleküler yola katılırlar. Bazı proteinler işlevlerini bağımsız olarak yerine getirirken, çoğu protein, uygun biyolojik aktiviteyi koordine etmek için bir bağlayıcı arayüz kullanarak diğer proteinlerle etkileşime girer1.
Biyomoleküler etkileşimler esas olarak, örneğin protein yüzeylerine, karmaşık stabiliteye veya etkileşimlerin kalıcılığına bağlı olarak2 ile ilgili proteinlerin farklı yapısal ve fonksiyonel özelliklerine göre sınıflandırılabilir3. Esansiyel proteinleri ve biyomoleküler etkileşimlerdeki rollerini tanımlamak, moleküler düzeyde biyokimyasal mekanizmaları anlamak için hayati önemesahiptir 4. Şu anda, bu etkileşimleri tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır5: in vitro6, in siliko7, canlı hücrelerde8, ex vivo 9 ve in vivo10, her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahiptir. 
İn vivo tahliller, tüm hayvanı deneysel bir araç olarak kullanarak gerçekleştirilir11 veex vivo tahliller, doğal koşullarda minimum değişiklik sağlayarak kontrollü bir dış ortamda doku ekstraktları veya tüm organlar (örneğin, kalp, beyin, karaciğer) üzerinde gerçekleştirilir. İn vivo ve ex vivo çalışmaların en yaygın uygulaması, potansiyel farmakolojik ajanların farmakokinetik, farmakodinamik ve toksisite etkilerini, genel güvenlik ve etkinliklerini sağlayarak insan denemelerinden önce değerlendirmektir12.
Biyomoleküler etkileşimler canlı hücreler içinde de tespit edilebilir. Canlı hücrelerin görüntülenmesi, belirli bir biyokimyasal yolun reaksiyonlarını yürütürken dinamik etkileşimleri gözlemlememizi sağlar13. Ayrıca, biyolüminesans veya floresan rezonans enerji transferi gibi tespit teknikleri, bu etkileşimlerin hücre14 içinde nerede ve ne zaman gerçekleştiği hakkında bilgi sağlayabilir. Canlı hücrelerde algılama çok önemli ayrıntılar sunsa da, bu tespit metodolojileri yerel biyolojiyi yansıtmayabilecek optik ve etiketlere dayanır; Ayrıca in vitro yöntemlerden daha az kontrollüdürler ve15'i gerçekleştirmek için özel uzmanlık gerektirirler.
In silico hesaplama yöntemleri öncelikle in vitro deneylerden önce hedef moleküllerin büyük ölçekli taranması için kullanılır. Hesaplamalı tahmin yöntemleri, bilgisayar tabanlı veritabanları, moleküler kenetlenme, nicel yapı-aktivite ilişkileri ve diğer moleküler dinamik simülasyon yaklaşımları köklü in silico araçları arasındadır16. Zahmetli deneysel tekniklerle karşılaştırıldığında, in silico aletleri yüksek hassasiyetle kolayca tahminlerde bulunabilir, ancak öngörücü performansta daha düşük doğrulukla17.
In vitro testler, standart biyolojik bağlamlarının dışındaki mikroorganizmalar veya biyolojik moleküllerle gerçekleştirilir. Biyomoleküler etkileşimleri in vitro yöntemlerle tasvir etmek, protein fonksiyonlarını ve karmaşık hücre işleyiş ağının arkasındaki biyolojiyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Tercih edilen tahlil metodolojisi, proteinin içsel özelliklerine, kinetik değerlerine ve etkileşimlerin modu ve yoğunluğuna göre seçilir18,19.
Hsp90/Cdc37 etkileşimi: Hsp90 ve Cdc37'yi birbirine bağlayan şaperon-kinaz yolu, tümör biyolojisi20'de umut verici bir terapötik hedeftir. Hsp90, hücre döngüsü kontrolünde, protein montajında, hücre sağkalımında ve sinyal yollarında merkezi bir rol oynar. İşlevleri için Hsp90'a güvenen proteinler, Cdc37 gibi bir ko-şaperon aracılığıyla kompleksleşme için Hsp90'a verilir. Hsp90 / Cdc37 kompleksi, çoğu protein kinazının katlanmasını kontrol eder ve çok sayıda hücre içi sinyal ağı için bir merkez görevi görür21. Akut miyeloblastik lösemi, multipl miyelom ve hepatosellüler karsinom22,23 gibi çeşitli malignitelerde yüksek ekspresyonu nedeniyle umut verici bir anti-tümör hedefidir.
Yaygın olarak kullanılan in vitro biyomoleküler etkileşim tespit teknikleri Ko-immünopresipitasyon (co-IP), biyolojik olarak ilgili etkileşimleri tanımlamak için antijen-antikor özgüllüğüne dayanan bir tekniktir24. Bu yöntemin birincil dezavantajı, düşük afiniteli etkileşimleri ve kinetik değerleri tespit edememesidir24. Kinetik değerlerin belirlenmesinde izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyolayer interferometrisi (BLI) ve FEB teknolojisi gibi biyofiziksel yöntemler tercih edilmektedir.
ITC, biyomoleküler etkileşimleri karakterize etmek için eksiksiz bir termodinamik analiz ile birlikte bağlanma enerjisinin belirlenmesine dayanan biyofiziksel bir tespit yöntemidir25. ITC'nin birincil avantajı, hedef proteinin herhangi bir etiketlenmesini veya sabitlenmesini gerektirmemesidir. ITC'nin karşılaştığı başlıca zorluklar, bir deney için gereken yüksek hedef protein konsantrasyonu ve küçük bağlayıcı entalpiler nedeniyle kovalent olmayan komplekslerin analizindeki zorluktur26. Hem SPR hem de BLI, sensör yüzeyindeki hedef molekülün immobilizasyonuna dayanan etiketsiz biyofiziksel tekniklerdir, ardından hareketsiz hedef27,28 üzerine analitin daha sonra enjekte edilmesidir. SPR'de, biyomoleküler etkileşimler sırasında kırılma indisindeki değişiklikler ölçülür27; BLI'da, yansıyan ışıktaki girişim,zamanın 28'inin bir fonksiyonu olarak dalga boyundaki bir değişiklik olarak gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Hem SPR hem de BLI, yüksek özgüllük, hassasiyet ve algılama yetenekleri sunmanın ortak avantajlarını paylaşır29. Her iki yöntemde de, hedef protein biyosensör yüzeyleri üzerinde hareketsiz hale getirilir ve bu nedenle, hedefin doğal konformasyonunda bir miktar kayıp olabilir, bu da spesifik ve spesifik olmayan etkileşimler arasında ayrım yapmayı zorlaştırır30. BLI, hedefi hareketsiz hale getirmek için pahalı tek kullanımlık fiber optik biyosensörler kullanır ve bu nedenle pahalı bir tekniktir31. Bu köklü biyomoleküler tespit araçlarıyla karşılaştırıldığında, FEB teknolojisi, kinetik karakterizasyon ile gerçek zamanlı olarak biyomoleküler algılama için düşük nanomolar konsantrasyonlar kullanarak güvenilir ve etiketsiz bir platform sunar. FEB teknolojisi ayrıca ITC'de karşılaşılan köpüren zorlukların üstesinden gelir ve SPR veya BLI'ya kıyasla daha uygun maliyetlidir.
Alan etkili transistör (FET) tabanlı biyosensörler, çeşitli biyomedikal uygulamalar sunarak biyomoleküler etkileşimleri tespit etmek için ortaya çıkan bir alandır. FET sisteminde, hedefler biyosensör çiplerine hareketsiz hale getirilir ve etkileşimler iletkenlikteki değişikliklerle tespit edilir32. Verimli bir elektronik biyosensörün geliştirilmesinde göz önünde bulundurulması gereken benzersiz özellik, sensör yüzeyini imal etmek için kullanılan kaplama malzemesinin yarı iletken doğası ve kimyasal kararlılığı gibi fizikokimyasal özelliklerdir33. FET için kullanılan silikon gibi geleneksel malzemeler, sensörlerin hassasiyetini sınırlamıştır, çünkü transistör kanalı ile düzgün çalışması için belirli bir ortam arasında sıkışmış oksit tabakaları gerektirir34. Dahası, silikon transistörler yüksek tuz ortamlarına duyarlıdır, bu nedenle doğal ortamlarındaki biyolojik etkileşimleri ölçmeyi zorlaştırır. Grafen bazlı biyosensör, mükemmel kimyasal stabilite ve elektrik alanı sunduğu için alternatif olarak sunulmaktadır. Grafen tek bir atomik karbon tabakası olduğundan, hem yarı iletken olarak son derece hassastır hem de biyolojik çözeltilerle kimyasal olarak uyumludur; Bu niteliklerin her ikisi de uyumlu elektronik biyosensörler üretmek için arzu edilir35. Grafen kaplı biyosensörler tarafından sunulan biyomoleküllerin olağanüstü ultra yüksek yükleme potansiyeli, grafen bazlı biyosensörlerin FEB teknolojisinin geliştirilmesine yol açmaktadır.
FEB teknolojisinin prensibi: FEB, bağlanma hedeflerinin hareketsiz bırakıldığı grafen biyosensör aracılığıyla elektrik akımını ölçen etiketsiz bir biyomoleküler tespit tekniğidir. İmmobilize protein ve analit arasındaki etkileşimler, gerçek zamanlı olarak izlenen akımdaki değişikliklere neden olur ve doğru kinetik ölçümler sağlar36.
Enstrümantasyon: FEB sistemi, bir grafen alan etkili transistör (gFET) sensör çipi ve deney boyunca sabit bir voltaj uygulayan bir elektronik okuyucudan oluşur (Şekil 1). Analit, biyosensör yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiş hedef proteine çözelti halinde uygulanır. Bir etkileşim meydana geldiğinde, akımdaki bir değişiklik gerçek zamanlı olarak ölçülür ve kaydedilir. Analit konsantrasyonu arttıkça, bağlı analitin fraksiyonu da artacak ve akımda daha yüksek değişimlere neden olacaktır. Cihazla birlikte verilen otomatik analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanılarak I-Response, biyolojik algılama birimleri (BU)37 cinsinden ölçülür ve kaydedilir. I-Response, hareketsiz hedefin analit ile etkileşimi üzerine gerçek zamanlı olarak ölçülen biyosensör çipi aracılığıyla akımdaki (I) değişiklik olarak tanımlanır. FEB otomatik analiz yazılımı, C-Yanıtının kapasitanstaki (C) değişiklikleri kaydettiği dinamik etkileşim olaylarına hem I-Yanıtını hem de C-Yanıtını analiz edebilir. Hem I-Response hem de C-Response'deki varyasyonlar doğrudan bağlı analitin fraksiyonuna karşılık gelir ve KD değerleri üretmek için daha fazla analiz edilebilir. Otomatik analiz yazılımının varsayılan tercihi I-Response'dir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Şekil 1: Deney düzeneğine genel bakış . (A) Grafen esaslı çip ve elektronik okuyucu. (B) Çip bileşenlerine genel bakış. Çip, sisteme akım sağlayan iki elektrota bağlanır. Çipin yüzeyi, etkinleştirildiğinde hedefi bağlayabilen grafen ile kaplıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Metodoloji: Başlangıçta, aktif biyosensör çipi FEB cihazına yerleştirilir (Şekil 1) ve ardından aşağıda özetlenen adımların uygulanması: (1) Kalibrasyon: Deney, temel denge tepkisini oluşturmak için 1x fosfat tamponlu salin (PBS; pH = 7.4) kullanılarak sistem kalibrasyonu ile başlar. (2) İlişkilendirme: Analit, çipe verilir ve bağlanma doygunluğuna ulaşılana kadar I-Response izlenir. (3) Ayrışma: Analit, 1x PBS kullanılarak ayrıştırılır. (4) Rejenerasyon: Analitin kalıntıları 1x PBS kullanılarak çıkarılır. (5) Yıkama: Bağlı ve bağlanmamış analitlerin çipten tamamen çıkarılması için 1x PBS kullanılarak toplam beş yıkama yapılır.
Analiz: Veri analizi, cihazla birlikte verilen tam otomatik yazılım kullanılarak gerçekleştirilir. Otomatik analiz yazılımı, KD değerine sahip bir Hill fit grafiği oluşturur. Hill fit grafiği, bir analitin hedef proteinle ilişkisini analit konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak tanımlar. Yarım maksimum yanıtın elde edildiği konsantrasyon, KD değeri ile orantılıdır. Düşük bir KD değeri, yüksek bağlanma afinitesini temsil eder ve bunun tersi de geçerlidir.
FEB deneyinden elde edilen verileri doğrulamak için, I-Yanıtları, veri gözden geçirme/dışa aktarma yazılımı kullanılarak her bir analit konsantrasyonu için her okuma noktasından çıkarılır ve aşağıda açıklandığı gibi diğer istatistiksel analiz yazılımlarına (bkz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated analysis software</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td>
			<td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>biosensor chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data review software</td>
			<td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag</td>
			<td>CelluSep,&#160; Membrane filtration products</td>
			<td>T2-10-15 
			CAS number: NA</td>
			<td>T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm &#216;, 0.32ml/cm, 15m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>EDC160322-02 
			CAS number: 25952-53-8</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC (Isothermal titration calorimetry) system</td>
			<td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M3671-50G 
			CAS number: 4432-31-9</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Graphene-based chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline) X 10</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001623237500&#160; 
			CAS number: 7758-11-4</td>
			<td>Liquid transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11855231 
			CAS number: NA</td>
			<td>Finnpipette F3 5-50 &#181;L, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-002-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>0105-001-003-001 
			CAS number: NA</td>
			<td>Liquid, transparent solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Cdc37</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab256157 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein Hsp90 beta</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80033 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet</td>
			<td>Excel, Microsoft office</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad, Prism</td>
			<td>NA 
			CAS number: NA</td>
			<td>Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Cardea (Nanomed)</td>
			<td>NHS160321-07 
			CAS number: 106627-54-7</td>
			<td>White powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Alex red</td>
			<td>LC 1093-800-000 
			CAS number: NA</td>
			<td>Tip 1-200 &#181;l, in bulk, 1,000 pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring biomolecular interaction between the molecular chaperone hsp90 and its client protein kinase cdc37 using field-effect biosensing technology

Biyomoleküler etkileşimler, fonksiyonel olarak ilgili biyolojik olayları düzenleyerek ve koordine ederek çok sayıda hücresel süreçte çok yönlü roller oynar. Proteinler, karbonhidratlar, vitaminler, yağ asitleri, nükleik asitler ve enzimler gibi biyomoleküller canlıların temel yapı taşlarıdır; sayısız yaşam olayını senkronize etmek için biyosistemlerdeki karmaşık ağlarda bir araya gelirler. Proteinler tipik olarak işlevlerini yerine getirmek için karmaşık interaktom ağları kullanırlar; bu nedenle, hem hücresel hem de organizma düzeylerindeki hücrelerdeki önemlerini çözmek için bu tür etkileşimleri değerlendirmek zorunludur. Bu amaç doğrultusunda, spesifik biyomoleküler etkileşimleri belirlemek için hızla gelişen bir teknoloji olan alan etkisi biyosensing'i (FEB) tanıtıyoruz. FEB, belirli etkileşimleri belirlemek için tezgah üstü, etiketsiz ve güvenilir bir biyomoleküler tespit tekniğidir ve yüksek kaliteli elektronik tabanlı biyosensörler kullanır. FEB teknolojisi, biyosensör yüzeyinde kullanılan biyouyumlu nanomalzemeler nedeniyle nanomolar aralıktaki etkileşimleri izleyebilir. Kavramın bir kanıtı olarak, ısı şoku proteini 90 (Hsp90) ve hücre bölünme döngüsü 37 (Cdc37) arasındaki protein-protein etkileşimi (PPI) açıklığa kavuşturulmuştur. Hsp90, birçok proteinin katlanması, stabilitesi, olgunlaşması ve kalite kontrolünde önemli bir rol oynayan, böylece çoklu hayati hücresel fonksiyonları düzenleyen ATP'ye bağımlı bir moleküler şaperondur. Cdc37, protein kinazına özgü bir moleküler şaperon olarak kabul edilir, çünkü protein kinazlarını özellikle tanır ve aşağı akış sinyal iletim yollarını düzenlemek için Hsp90'a alır. Bu nedenle, Cdc37, Hsp90'ın bir ko-şaperonu olarak kabul edilir. Şaperon-kinaz yolu (Hsp90 / Cdc37 kompleksi) hücresel büyümeyi teşvik eden çoklu malignitelerde hiper-aktive edilir; bu nedenle, kanser tedavisi için potansiyel bir hedeftir. Bu çalışma, Hsp90/Cdc37 model sistemini kullanarak FEB teknolojisinin verimliliğini göstermektedir. FEB, iki protein arasında güçlü bir PPI tespit etti (üç bağımsız deneyde 0.014 μM, 0.053 μM ve 0.072 μM KD değerleri). Özetle, FEB, hızlı ve doğru ölçümler sunan, etiketsiz ve uygun maliyetli bir PPI algılama platformudur.

Deney 1'in sonuçları: Hedef protein Hsp90 (500 nM), yukarıda açıklandığı gibi hedef immobilizasyon protokolünü takiben çipe hareketsiz hale getirildi. İlk deney için, literatürde bulunan verilere dayanarak, 25 nM ila 5.000 nM arasında değişen 10 analit proteini Cdc37 konsantrasyonu hazırlanmıştır (bkz. Tablo 1).
Deneyin adımları, I-Response'da meydana gelen değişiklikler takip edilerek gerçek zamanlı olarak izlenebilir (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology at JoVE.

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Alan etkili biyosensing (FEB), biyomoleküler etkileşimleri tespit etmek için etiketsiz bir tekniktir. Elektrik akımını, bağlanma hedeflerinin hareketsiz bırakıldığı grafen biyosensörü aracılığıyla ölçer. Hsp90 ve Cdc37 arasındaki biyomoleküler etkileşimleri değerlendirmek için FEB teknolojisi kullanıldı ve iki protein arasında güçlü bir etkileşim tespit edildi.

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB, hızlı ve doğru ölçümler sunan, etiketsiz ve uygun maliyetli bir __ ___ Bu yöntem, bilinen veya bilinmeyen etkileşimlerin doğrulanmasını ve biyomoleküler etkileşimlerin potansiyel inhibitörlerini test etmenin kolay bir yolunu sunar. FEB'in temel avantajı, açık, elle pipetleme platformu ile deney boyunca kullanıcıyı aradan geçiren ve kullanıcıların çok az veya hiç eğitim almadan çalışmasını sağlayan otomatik, kullanıcı dostu yazılımıdır.FEB teknolojisi ayrıca farmasötiklerin çeşitli alanlarında, küçük moleküllerin, peptitlerin ve proteinlerin biyomoleküler analizinde, in vitro biyolojik aktiviteyi kolayca in vivo etkinliğe çevirerek ilaç doğrulamasında uygulamalar sunmaktadır. Yeni başlayan biri olarak, güvenilir bir KD değeri elde etmek için deneyi optimize etmek için doğru analit konsantrasyonlarını seçmede zorluklarla karşılaşabilirsiniz. Talaş işlevselleştirme sürecine ve uygun tampon değişimine dikkat etmenizi öneririz.Eşit hacimlerde EDC ve sülfo-NHS çözeltisini yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırarak başlayın. Şirket tarafından sağlanan biyosensör çipini, takılı bir kapağı olan cam bir Petri kabına yerleştirin. Talaş aktivasyonunda yer alan tüm işlevselleştirme adımlarının Petri kabı içinde yapılması önerilmektedir.Biyosensör çipine 50 mikrolitre tek molar MES tamponu uygulayın. Oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, tamponu aspire edin ve hemen sensör çipine 50 mikrolitre EDC sülfo-NHS çözeltisi uygulayın.Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. EDC sülfo-NHS çözeltisini çipten aspire edin ve 50 mikrolitre tek molar MES tamponu uygulayın. MES tamponunu aspire edin ve çipi 50 mikrolitre 1X PBS ile iki kez durulayın.PBS'yi çipten aspire edin ve hedef molekül Hsp90'ı ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, hedef molekülü içeren çözeltiyi aspire edin ve 50 mikrolitre 1X PBS ile üç kez durulayın.1X PBS çözeltisini çipten aspire edin ve bir söndürme çözeltisinin 50 mikrolitresini ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bir çözeltiyi çipten söndürün ve iki çözeltiyi söndürmek için 50 mikrolitre ekleyin.Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, çipten iki çözeltiyi söndürün ve çipi 50 mikrolitre 1X PBS kullanarak beş kez durulayın, sensör üzerindeki son PBS damlacığını bırakın. Cdc37 için analit seyreltme serisini istenen konsantrasyon aralığında hazırlayın.Deneyi, güvenilir bir ayrışma sabiti veya KD değeri elde etmek için en az sekiz farklı analit konsantrasyonu içerecek şekilde tasarlayın ve bu farklı seyreltmeleri kalibrasyon ve hedef protein için kullanılan aynı tamponda hazırlayın. Çipi dikkatlice cihaza yerleştirin. Yazılımın açık olduğundan ve LED ışığının yeşile döndüğünden emin olun.Ardından, otomatik yazılımdaki Denemeyi Çalıştır modülüne basın ve rejenerasyon veya istenen başka bir protokolle 10 nokta seçin. Operatör adı, deney adı, tarih, rejenerasyon tamponu, hareketsiz hedef ve çözeltideki analit gibi ayrıntıları doldurun. Yazılımda görüntülenen Denemeyi Başlat düğmesine basın ve otomatik yazılım tarafından gösterilen talimatları izleyin.Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, kalan PBS çözeltisini çipten aspire edin ve kalibrasyon tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Devam düğmesine basın ve kalibrasyon adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, kalibrasyon adımı için belirlenen uç noktayı takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.Daha sonra, kalibrasyon tamponunu çipten aspire ederek ve en düşük analit konsantrasyonunun 50 mikrolitresini uygulayarak bir analit ilişkilendirmesi gerçekleştirin. Devam düğmesine basın ve ilişkilendirme adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, devam etmek için bir uyarı alarmı ile ilişkilendirme adımının bitiş noktasını görüntüler.Bir analit ayrışması gerçekleştirmek için, analit çözeltisini çipten aspire edin ve ayrışma tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Devam düğmesine basın. Ayrıştırma adımı süresinden sonra, yazılım bir uyarı alarmı ile ayrıştırma adımının uç noktasını görüntüler.Daha sonra, ayrışma çözeltisini çipten aspire ederek ve rejenerasyon tamponunun 50 mikrolitresini uygulayarak talaş rejenerasyonu gerçekleştirin. Ardından, Devam düğmesine basın. Rejenerasyon adımının tamamlanması genellikle yaklaşık 30 saniye sürer.Bundan sonra, yazılım rejenerasyon adımının bitiş noktasını takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler. Son olarak, çipi yıkamak için, rejenerasyon çözeltisini çipten aspire edin ve yıkama tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Çözeltiyi çipten aspire edin ve bunu beş kez tekrarlayın.Yıkama tamponunun son damlasını çip üzerinde bırakın. Ardından, Devam düğmesine basın ve yazılım ekranında yıkama adımı süresi bitene kadar 30 saniye bekleyin. Kullanılan her analit konsantrasyonu için adımları tekrarlayın.Kalibrasyonun beş adımı, analit ilişkisi, ayrışma, rejenerasyon ve beş kez yıkama bir döngü oluşturur. Deneyin sonundaki otomatik analiz yazılımındaki Analiz düğmesine basın. Tüm deneme noktalarını içeren bir görüntüleme penceresi görünecektir.Öngörülen protokol için kullanılan analit konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olun. KD değerini otomatik olarak oluşturmak için Analizi Çalıştır düğmesine basın. Yazılım, analit konsantrasyonlarını, dengedeki ayrışma sabitinin hesaplandığı karşılık gelen I-tepkilerine karşı çizerek bir tepe fit grafiği oluşturur.Hedef protein Hsp90 çipe hareketsiz hale getirildi ve ilk deney için, 25 nanomolar ila 5.000 nanomolar arasında değişen 10 analit proteini Cdc37 konsantrasyonu hazırlandı. Birinci denemeden oluşturulan veri dosyaları burada gösterilmiştir. Gerçek zamanlı olarak izlenen deneysel veriler burada gösterilmiştir.Y ekseni, biyosensör birimlerindeki I-tepkisine karşılık gelir ve X ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Burada gösterilen grafiksel görüntü, otomatik analiz yazılımından oluşturulan tepe fit grafiğini temsil eder. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki I-tepkisine karşılık gelir ve X-ekseni, deneydeki farklı analit konsantrasyonlarına karşılık gelir.Burada gösterilen grafik görüntü, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme grafiğini temsil eder. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-tepkisine karşılık gelir ve X ekseni, analit Cdc37'nin farklı konsantrasyonlarına karşılık gelir. İkinci deneyde, 0.4 nanomolar ila 200 nanomolar arasında değişen farklı bir konsantrasyon seti kullanıldı ve oluşturulan veri dosyaları burada gösterildi.Grafik görüntüler, Hsp90 ve Cdc37 etkileşiminin ITC termogramını temsil eder. Burada, Cdc37'nin 298.15 Kelvin'de Hsp90'a ardışık enjeksiyonları nedeniyle elde edilen karşılık gelen ısı evrimleşen eğriler gösterilmektedir. Burada kullanılan diferansiyel güç, zamanın bir fonksiyonudur.Bu grafikteki entegre veri noktaları, Hsp90'ın Cdc37'ye Mueller oranına karşı karşılık gelen normalleştirilmiş ısıyı belirtir. Burada kullanılan açık pipetleme yaklaşımı, kullanıcının el pipetlemesinde temel bir ustalığa sahip olmasını ve biyosensöre uçla dokunmadığından emin olmasını gerektirir. Adım zamanlamasının tekrarlanabilirliği tamamen kullanıcıya bağlıdır.Araştırmacı iki biyomolekül arasındaki etkileşimi karakterize ettikten sonra, FEB sistemini kullanarak spesifik biyomoleküler etkileşimi hedefleyen potansiyel inhibitörler veya modülatörler tasarlayarak bir tarama deneyi yapabiliriz. Bu prosedür, proteinlerin yanı sıra ilaçlar ve peptitler de dahil olmak üzere küçük moleküller arasındaki bilinen ve yeni etkileşimi tanımlamak, doğrulamak ve ölçmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biyokimya

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...