Name: a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) for HeLa-Cre-cellerne og pRD-RIPE og pCAGGS-Cre plasmider. Vi takker Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes og Anselmo Moriscot for deres støtte.

En oversigt over den protokol, der er beskrevet her, er afbildet i figur 1.
1. Plasmid konstruktion
<ol><li>pCAGGS-Cre: Dette plasmid blev leveret af Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Forstærk pre-miR-17-92 ved PCR ved hjælp af 0,5 μM af hver specifik primer (materialetabel), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP'er, 1x Taq PCR-buffer og 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Udfør en pcr-rea...

<ol>
	<li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+by+the+spliceosome.">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+structure+and+function.">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome.">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li><li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+devices+of+the+spliceosome:+Motors,+clocks,+springs,+and+things.">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability.">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li><li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing.">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li><li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antigen+R+(HuR)+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer.">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li><li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons:+MicroRNA+biogenesis+via+splicing.">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li><li>Michlewski, G., C&#225;ceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis.">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons,+an+emerging+class+of+atypical+miRNA.">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li><li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m(6)A-dependent+nuclear+RNA+processing+events.">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li><li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells.">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92.">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes &amp; Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells.">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li><li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins.">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs.">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438 (2016).</li><li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon.">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).</li><li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+HuR+function.">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis.">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth.">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li><li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation.">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li><li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells.">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li></ol>

Præ-mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression, og dens kontrol kan udløse stærke virkninger på cellefænotypiske modifikationer22,23. Mere end 70% af miRNA'er transskriberes fra introner hos mennesker, og vi antog, at deres behandling og modning kunne lettes ved at splejse regulatoriske proteiner 24,25. Vi udviklede en metode til at analysere intronisk miRNA-behandling og fu...

Forløber mRNA-splejsning er en vigtig proces til regulering af genekspression i eukaryoter1. Fjernelsen af introns og foreningen af exoner i modent RNA katalyseres af splejseosomet, et 2 megadalton ribonukleoproteinkompleks sammensat af 5 snRNA'er (U1, U2, U4, U5 og U6) sammen med mere end 100 proteiner 2,3. Splejsningsreaktionen forekommer co-transkriptionelt, og splejseosomet samles ved hver ny intron styret af genkendelse af konserverede splejsningssteder ved exon-intron-grænser og inden for intron4. Forskellige introns kan have forskellige splejsningshastigheder på trods af den bemærkelsesværdige bevarelse af splejsningskomplekset og dets komponenter. Ud over forskellene i bevarelse af splejsningssteder kan regulatoriske sekvenser fordelt på introns og exoner guide RNA-bindende proteiner (RBP) og stimulere eller undertrykke splejsning 5,6. HuR er en allestedsnærværende udtrykt RBP og er en vigtig faktor for at kontrollere mRNA-stabilitet7. Tidligere resultater fra vores gruppe viste, at HuR kan binde til introner indeholdende miRNA'er, hvilket indikerer, at dette protein kan være en vigtig faktor for at lette miRNA-behandling og modning, hvilket også fører til generering af alternative splejsningsisoformer 6,8,9.
Mange mikroRNA'er (miRNA'er) er kodet fra introniske sekvenser. Mens nogle er en del af intronen, er andre kendt som "mirtrons" og er dannet af hele intron 10,11. miRNA'er er korte ikke-kodende RNA'er, der spænder fra 18 til 24 nukleotider i længden12. Deres modne sekvens viser delvis eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA'er, hvilket påvirker translation og / eller mRNA-henfaldshastigheder. Kombinationerne af miRNA'er og mål driver cellen til forskellige resultater. Flere miRNA'er kan drive celler til pro- eller antitumorfænotyper13. Onkogene miRNA'er er normalt målrettet mod mRNA'er, der udløser en undertrykkende egenskab, hvilket fører til øget cellulær proliferation, migration og invasion14. På den anden side kan tumorundertrykkende miRNA'er målrette onkogene mRNA'er eller mRNA'er relateret til øget celleproliferation.
Forarbejdning og modning af miRNA'er er også afhængige af deres oprindelse. De fleste introniske miRNA'er behandles med deltagelse af mikroprocessoren, dannet af ribonuklease Drosha og proteinkofaktorer12. Mirtroner behandles med aktiviteten af splejseosomet uafhængigt af Drosha15. I betragtning af den høje frekvens af miRNA'er, der findes i introns, antog vi, at RNA-bindende proteiner involveret i splejsning også kunne lette behandlingen og modningen af disse miRNA'er. Især RBP hnRNP A2 / B1 har allerede været forbundet med mikroprocessoren og miRNA-biogenese16. 
Vi har tidligere rapporteret, at flere RNA-bindende proteiner, såsom hnRNP'er og HuR, er forbundet med introniske miRNA'er ved massespektrometri17. HuR's (ELAVL1) tilknytning til miRNA'er fra miR-17-92 intronisk klynge blev bekræftet ved anvendelse af immunoprecipitation og i silicoanalyse 9. miR-17-92 er en intronisk miRNA-klynge sammensat af seks miRNA'er med øget ekspression i forskellige kræftformer 18,19. Denne klynge er også kendt som "oncomiR-1" og består af miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b og miR-92a. miR-19a og miR-19b er blandt de mest onkogene miRNA'er i denne klynge19. Den øgede ekspression af HuR stimulerer miR-19a og miR-19b syntese9. Da introniske regioner, der flankerer denne klynge, er forbundet med HuR, udviklede vi en metode til at undersøge, om dette protein kunne regulere miR-19a og miR-19b ekspression og modning. En vigtig forudsigelse af vores hypotese var, at HuR som et regulatorisk protein kunne lette miRNA-biogenese, hvilket førte til fænotypiske ændringer. En mulighed var, at miRNA'er blev behandlet ved stimulering af HuR, men ikke ville være modne og funktionelle, og derfor ville virkningerne af proteinet ikke direkte påvirke fænotypen. Derfor udviklede vi et splejsningsreporterassay for at undersøge, om en RBP som HuR kunne påvirke biogenesen og modningen af et intronisk miRNA. Ved at bekræfte miRNA-behandling og modning viser vores assay interaktionen med målsekvensen og dannelsen af et modent og funktionelt miRNA. I vores assay kobler vi ekspressionen af en intronisk miRNA-klynge med et luciferaseplasmid for at kontrollere, om miRNA-målbinding i dyrkede celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-RAP-IB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-miR-17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-RIPE-donor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK-Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HuR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>mAb&#160;12582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/high-glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB719150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E859-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV&#8482;-3 Expression Vector</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10966-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiR-GLO</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse OUT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>752899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol-LS reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/EDTA 10X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R616A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG 
			CTACTATATCAGTTTGCACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA 
			GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT 
			GGTTATGAAGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG 
			GGACTTGTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG 
			GGATTATGCTGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG 
			TACATTTAACAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA 
			GAATAATGTCAAAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC 
			TCAACAGGCCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8 for Mac OS X</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells

MicroRNA'er (miRNA'er) er korte RNA-molekyler, der er udbredt i eukaryoter. De fleste miRNA'er transskriberes fra introner, og deres modning involverer forskellige RNA-bindende proteiner i kernen. Modne miRNA'er formidler ofte genhæmning, og dette er blevet et vigtigt redskab til at forstå post-transkriptionelle begivenheder. Derudover kan det udforskes som en lovende metode til genterapier. Der mangler imidlertid i øjeblikket direkte metoder til vurdering af miRNA-ekspression i pattedyrcellekulturer. Her beskriver vi en effektiv og enkel metode, der hjælper med at bestemme miRNA-biogenese og modning gennem bekræftelse af dets interaktion med målsekvenser. Dette system tillader også adskillelse af eksogen miRNA-modning fra dets endogene aktivitet ved anvendelse af en doxycyclin-inducerbar promotor, der er i stand til at kontrollere primær miRNA (pri-miRNA) transkription med høj effektivitet og lave omkostninger. Dette værktøj tillader også modulering med RNA-bindende proteiner i et separat plasmid. Ud over dets anvendelse med en række forskellige miRNA'er og deres respektive mål kan det tilpasses forskellige cellelinjer, forudsat at disse er modtagelige for transfektion.

Vores oprindelige hypotese var, at HuR kunne lette intronisk miRNA-biogenese ved at binde til dets præ-miRNA-sekvens. Forbindelsen mellem HuR-ekspression og miR-17-92 klyngebiogenese kunne således pege på en ny mekanisme, der styrer modningen af disse miRNA'er. Overekspression af HuR ved transfektion af pFLAG-HuR blev bekræftet i tre forskellige cellelinjer: HeLa, BCPAP og HEK-293T (figur 2). Som kontroller blev utransficerede celler og celler transficeret med tomme pFLAG-vektor...

Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Vi udviklede et intronisk mikroRNA biogenese reporterassay til brug i celler in vitro med fire plasmider: en med intronisk miRNA, en med målet, en til at overudtrykke et regulatorisk protein og en til Renilla luciferase. MiRNA'et blev behandlet og kunne kontrollere luciferaseekspression ved at binde til målsekvensen.

En reporterassay for at analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Vores protokol omhandler virkningerne af regulatoriske RNA-bindende proteiner på mikroRNA-biogenese og modning direkte fra cellekulturer. Den metode, vi beskriver, kan udføres med almindelige cellekulturreagenser og er relativt hurtig. Denne metode kan være vigtig for at studere de fænotypiske virkninger af mikroRNA'er og deres mål i forskellige typer eukaryote celler.Normale eller sygdomslignende celler kan bruges. Det er vigtigt at vælge cellelinjer, der er modtagelige for transfektion, udføre passende transfektions- og induktionskontroller for at observere ændringerne i målaffinitet gennem luciferaseaktivitet. Til at begynde med skal du vedligeholde cellerne i DMEM, højt glukosetilskud i 100 millimeter petriskåle og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i en befugtet, kontrolleret atmosfæreinkubator med 5% kuldioxid.For at løsne klæbende celler inkuberes det med trypsin-EDTA-opløsning ved 37 grader Celsius i tre til fem minutter. For at udføre transfektioner blandes 200 nanogram DNA og 1,25 mikroliter transfektionsreagens i 100 mikroliter af kulturmediet og tilsættes transfektionsblandingen til cellerne. Derefter inkuberes cellerne med transfektionsblandingerne i fire timer ved 37 grader Celsius.Udskift derefter mediet med medium indeholdende 10% FBS og inkuber i yderligere 24 timer, før du tilføjer antibiotika til udvælgelse. For at transficere pFLAG-HuR og MT-pFLAG til HeLa skal du vælge celler ved at øge koncentrationen af Geneticin fra 100 mikrogram pr. milliliter til 1000 mikrogram pr. milliliter, hvilket genererer stabile cellelinjer. Bekræft derefter overekspression med kvantitativ PCR ved hjælp af specifikke primere til HuR mRNA.Transficer plasmider i HeLa-Cre-celler med 40 nanogram pTK-Renilla, derefter pRD miR 17-92, genererer HeLa-Cre miR 17-92 og vælger med et mikrogram pr. milliliter puromycin. Derefter transfekter HeLa-Cre miR 17-92 med pTK-Renilla og pmirGLO RAB1B 3'UTR eller pmirGLO krypteret 1B 3'UTR separat. Vælg derefter ved hjælp af penicillin og streptomycin, hvilket resulterer i generering af luc RAB1B og luc scrambled.Transficer derefter cellerne med pFLAG-HuR eller MT-PFLAG, som de tidligere har vist. Fortsæt til cellekultur med HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 krypteret, HeLa-Cre miR 17-92 HuR og HeLa-Cre miR 1792 HuR-lås, indtil ca. 80% af sammenløbet er nået. Inducer derefter med en mikroliter doxycyclin i 30 minutter ved 37 grader Celsius og hold også alle cellerne uden doxycyclin som kontroller i samme periode.Hvis du vil kvantificere og sammenligne forskellige luminescensintensiteter, skal du bruge det dobbelte luciferase reporteranalysesæt. Før analysen påbegyndes, optøes luciferase assayopløsninger og lad dem stå ved stuetemperatur. Forbered derefter blandingen Stop og Glo ved at blande 200 mikroliter af substratet i 10 ml luciferase assay buffer to.Bland derefter 10 ml luciferase assay buffer to i den gule modbydelighed af luciferase assay substrat to for at forberede blandingen, LAR II, og ryst godt. Derefter overføres opløsningerne til 15 milliliter centrifugerør, der tidligere er identificeret og beskyttet mod lys. Udfør derefter luminescensaflæsningerne ved hjælp af udstyr som Synergy og mål udtrykt luciferase som relative lysenheder, og eksporter derefter resultaterne til et regneark til yderligere statistisk analyse.Udfør normalisering af firefly luciferase aktivitet ved kontrol Renilla og plot det som relative lysenheder i en grafik, mens du gentager for grupper med og uden doxycyclin induktion. Overekspression af HuR ved transfektion af pFLAG-HuR blev bekræftet i HeLa, BCPAP og HEK293T cellelinje, og det blev observeret, at HuR-overekspression i disse celler stimulerer ekspressionen af miR19A. En stærk reduktion i luciferaseaktivitet blev observeret med RAB1B 3'UTR ved øget miR19A- og miR19B-ekspression fra pRD miR 17-92 sammenlignet med HeLa-Cre-celler.Transfektionen af pFLAG-HuR i HeLa-celler ændrede ikke luciferaseaktiviteten. Imidlertid reducerede overekspression af HuR kombineret med doxycyclintilskudsstimulerende ekspression af miR 17-92-klyngen yderligere luciferaseaktivitet. Efter at have bekræftet RNA-bindende proteins rolle i mikroRNA-modning, vil cellekinetik og cellecyklusanalyse være vigtig for at forstå de store ændringer, der fremmes af proteinet i mikroRNA'er.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Anvendelsen af Laser mikro-bestråling for undersøgelse af enkelt og dobbelt Strand bryde reparation i pattedyrceller

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Påvisning af en cirkulerende mikroRNA brugerdefineret Panel hos patienter med metastatisk kolorektal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Kvantificering af telomerlængde ved hjælp af ikke-radioaktiv kemiluminescensdetektion

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Forfatter Spotlight: Optimering af ydeevneparametre for TAGGG telomerlængdeanalyse  

Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...