Name: a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

De auteurs zijn E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) dankbaar voor de HeLa-Cre cellen en pRD-RIPE en pCAGGS-Cre plasmiden. We bedanken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes en Anselmo Moriscot voor hun steun.

Een overzicht van het hier beschreven protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Plasmide constructie
<ol><li>pCAGGS-Cre: Dit plasmide werd geleverd door Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplify pre-miR-17-92 door PCR met behulp van 0,5 μM van elke specifieke primer (Tabel van Materialen), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-buffer en 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Voer een ...

<ol>
	<li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+by+the+spliceosome.">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+structure+and+function.">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome.">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li><li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+devices+of+the+spliceosome:+Motors,+clocks,+springs,+and+things.">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability.">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li><li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing.">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li><li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antigen+R+(HuR)+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer.">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li><li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons:+MicroRNA+biogenesis+via+splicing.">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li><li>Michlewski, G., C&#225;ceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis.">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons,+an+emerging+class+of+atypical+miRNA.">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li><li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m(6)A-dependent+nuclear+RNA+processing+events.">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li><li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells.">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92.">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes &amp; Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells.">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li><li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins.">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs.">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438 (2016).</li><li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon.">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).</li><li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+HuR+function.">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis.">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth.">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li><li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation.">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li><li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells.">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li></ol>

Pre-mRNA-splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie en de controle ervan kan sterke effecten op celfenotypische modificaties veroorzaken22,23. Meer dan 70% van de miRNA's wordt getranscribeerd van introns bij mensen, en we veronderstelden dat hun verwerking en rijping zou kunnen worden vergemakkelijkt door regulerende eiwittente splitsen 24,25. We ontwikkelden een methode om intronische ...

Precursor mRNA splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie in eukaryoten1. De verwijdering van introns en de vereniging van exonen in volwassen RNA wordt gekatalyseerd door het spliceosoom, een ribonucleoproteïnecomplex van 2 megadalton dat bestaat uit 5 snRNA's (U1, U2, U4, U5 en U6) samen met meer dan 100 eiwitten 2,3. De splicingreactie vindt co-transcriptioneel plaats en het spliceosoom wordt geassembleerd bij elk nieuw intron geleid door de herkenning van geconserveerde spliceplaatsen op exon-introngrenzen en binnen het intron4. Verschillende introns kunnen verschillende splicingsnelheden hebben, ondanks de opmerkelijke conservering van het spliceosoomcomplex en zijn componenten. Naast de verschillen in het behoud van de splice-site, kunnen regulerende sequenties verdeeld over introns en exonen RNA-bindende eiwitten (RBP) sturen en splicing 5,6 stimuleren of onderdrukken. HuR is een alomtegenwoordig tot expressie gebrachte RBP en is een belangrijke factor om mRNA-stabiliteit te beheersen7. Eerdere resultaten van onze groep toonden aan dat HuR kan binden aan introns die miRNA's bevatten, wat aangeeft dat dit eiwit een belangrijke factor kan zijn om miRNA-verwerking en rijping te vergemakkelijken, wat ook leidt tot het genereren van alternatieve splicingisovormen 6,8,9.
Veel microRNA's (miRNA's) zijn gecodeerd vanuit intronische sequenties. Terwijl sommige deel uitmaken van de intron, staan andere bekend als "mirtrons" en worden gevormd door de gehele intron 10,11. miRNA's zijn korte niet-coderende RNA's, variërend van 18 tot 24 nucleotiden in lengte12. Hun volwassen sequentie vertoont gedeeltelijke of volledige complementariteit met doelsequenties in mRNA's, waardoor de translatie- en/of mRNA-vervalsnelheden worden beïnvloed. De combinaties van miRNA's en doelen drijven de cel naar verschillende uitkomsten. Verschillende miRNA's kunnen cellen naar pro- of antitumorale fenotypendrijven 13. Oncogene miRNA's richten zich meestal op mRNA's die een onderdrukkend kenmerk veroorzaken, wat leidt tot verhoogde cellulaire proliferatie, migratie en invasie14. Aan de andere kant kunnen tumorsuppressieve miRNA's zich richten op oncogene mRNA's of mRNA's die verband houden met verhoogde celproliferatie.
De verwerking en rijping van miRNA's zijn ook afhankelijk van hun oorsprong. De meeste intronische miRNA's worden verwerkt met deelname van de microprocessor, gevormd door de ribonuclease Drosha en eiwitcofactoren12. Mirtrons worden verwerkt met de activiteit van het spliceosoom onafhankelijk van Drosha15. Gezien de hoge frequentie van miRNA's in introns, veronderstelden we dat RNA-bindende eiwitten die betrokken zijn bij splicing ook de verwerking en rijping van deze miRNA's zouden kunnen vergemakkelijken. Met name de RBP hnRNP A2/B1 is al in verband gebracht met de microprocessor en miRNA-biogenese16. 
We hebben eerder gemeld dat verschillende RNA-bindende eiwitten, zoals hnRNPs en HuR, geassocieerd zijn met intronische miRNA's door massaspectrometrie17. HuR's (ELAVL1) associatie met miRNA's uit de miR-17-92 intronische cluster werd bevestigd met behulp van immunoprecipitatie en in silico-analyse 9. miR-17-92 is een intronisch miRNA-cluster bestaande uit zes miRNA's met verhoogde expressie in verschillende kankers18,19. Dit cluster staat ook bekend als "oncomiR-1" en bestaat uit miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b en miR-92a. miR-19a en miR-19b behoren tot de meest oncogene miRNA's van dit cluster19. De verhoogde expressie van HuR stimuleert miR-19a en miR-19b synthese9. Omdat intronische gebieden die dit cluster flankeren geassocieerd zijn met HuR, hebben we een methode ontwikkeld om te onderzoeken of dit eiwit miR-19a en miR-19b expressie en rijping kan reguleren. Een belangrijke voorspelling van onze hypothese was dat HuR, als regulerend eiwit, miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken, wat zou leiden tot fenotypische veranderingen. Een mogelijkheid was dat miRNA's werden verwerkt door de stimulatie van HuR, maar niet volwassen en functioneel zouden zijn en daarom zouden de effecten van het eiwit het fenotype niet direct beïnvloeden. Daarom hebben we een splicing reporter assay ontwikkeld om te onderzoeken of een RBP zoals HuR de biogenese en rijping van een intronisch miRNA kan beïnvloeden. Door miRNA-verwerking en -rijping te bevestigen, toont onze test de interactie met de doelsequentie en de generatie van een volwassen en functioneel miRNA. In onze test koppelen we de expressie van een intronisch miRNA-cluster aan een luciferaseplasmide om te controleren op miRNA-doelbinding in gekweekte cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-RAP-IB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-miR-17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-RIPE-donor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK-Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HuR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>mAb&#160;12582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/high-glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB719150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E859-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV&#8482;-3 Expression Vector</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10966-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiR-GLO</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse OUT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>752899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol-LS reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/EDTA 10X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R616A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG 
			CTACTATATCAGTTTGCACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA 
			GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT 
			GGTTATGAAGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG 
			GGACTTGTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG 
			GGATTATGCTGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG 
			TACATTTAACAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA 
			GAATAATGTCAAAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC 
			TCAACAGGCCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8 for Mac OS X</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte RNA-moleculen die wijdverspreid zijn in eukaryoten. De meeste miRNA's worden getranscribeerd van introns en hun rijping omvat verschillende RNA-bindende eiwitten in de kern. Volwassen miRNA's bemiddelen vaak gen-uitschakeling, en dit is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het begrijpen van post-transcriptionele gebeurtenissen. Daarnaast kan het worden onderzocht als een veelbelovende methodologie voor gentherapieën. Er is momenteel echter een gebrek aan directe methoden voor het beoordelen van miRNA-expressie in zoogdiercelculturen. Hier beschrijven we een efficiënte en eenvoudige methode die helpt bij het bepalen van miRNA-biogenese en rijping door bevestiging van de interactie met doelsequenties. Dit systeem maakt ook de scheiding mogelijk van exogene miRNA-rijping van zijn endogene activiteit met behulp van een doxycycline-induceerbare promotor die in staat is om primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie met hoge efficiëntie en lage kosten te beheersen. Deze tool maakt ook modulatie met RNA-bindende eiwitten in een apart plasmide mogelijk. Naast het gebruik ervan met een verscheidenheid aan verschillende miRNA's en hun respectieve doelen, kan het worden aangepast aan verschillende cellijnen, op voorwaarde dat deze vatbaar zijn voor transfectie.

Onze eerste hypothese was dat HuR intronische miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken door zich te binden aan zijn pre-miRNA-sequentie. De verbinding van HuR-expressie en miR-17-92 clusterbiogenese zou dus kunnen wijzen op een nieuw mechanisme dat de rijping van deze miRNA's regelt. Overexpressie van HuR bij transfectie van pFLAG-HuR werd bevestigd in drie verschillende cellijnen: HeLa, BCPAP en HEK-293T (Figuur 2). Als controles werden niet-getransfecteerde cellen en cellen get...

Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Ons protocol richt zich op de effecten van regulerende RNA-bindende eiwitten op microRNA-biogenese en rijping, rechtstreeks uit celculturen. De methode die we beschrijven kan worden uitgevoerd met gemeenschappelijke celkweekreagentia en is relatief snel. Deze methode kan belangrijk zijn om de fenotypische effecten van microRNA's en hun doelwitten in verschillende soorten eukaryote cellen te bestuderen.Normale of ziekte-achtige cellen kunnen worden gebruikt. Het is belangrijk om cellijnen te kiezen die vatbaar zijn voor transfectie, adequate transfectie- en inductiecontroles uit te voeren om de veranderingen in doelaffiniteit door luciferaseactiviteit te observeren. Om te beginnen, onderhoud de cellen in DMEM, hoog glucosesupplement in petrischalen van 100 millimeter en incubeer de cellen op 37 graden Celsius in een bevochtigde, gecontroleerde atmosfeerincubator met 5% koolstofdioxide.Om aanhangende cellen los te maken, incubeer het met trypsine-EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Om transfecties uit te voeren, mengt u 200 nanogram DNA en 1,25 microliter transfectiereagens in 100 microliter van het kweekmedium en voegt u het transfectiemengsel toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen met de transfectiemengsels gedurende vier uur bij 37 graden Celsius.Vervang vervolgens het medium door een medium met 10% FBS en incubeer nog eens 24 uur voordat u de antibiotica toevoegt voor selectie. Om pFLAG-HuR en MT-pFLAG in HeLa te transfecteren, selecteert u cellen door de concentratie geneticïne te verhogen van 100 microgram per milliliter naar 1000 microgram per milliliter, waardoor stabiele cellijnen worden gegenereerd. Bevestig vervolgens overexpressie met kwantitatieve PCR met behulp van specifieke primers voor HuR-mRNA.Transfecteer de plasmiden in HeLa-Cre-cellen met 40 nanogram pTK-Renilla, vervolgens pRD miR 17-92, genereer HeLa-Cre miR 17-92 en selecteer met één microgram per milliliter puromycine. Vervolgens transfect HeLa-Cre miR 17-92 met pTK-Renilla en pmirGLO RAB1B 3'UTR of pmirGLO afzonderlijk gecrambled 1B 3'UTR. Selecteer vervolgens met penicilline en streptomycine, wat resulteert in de generatie van luc RAB1B en luc scrambled.Transfecteer vervolgens de cellen met pFLAG-HuR of MT-PFLAG zoals ze eerder hebben aangetoond. Ga verder met celkweek met HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 scrambled, HeLa-Cre miR 17-92 HuR en HeLa-Cre miR 1792 HuR lock totdat ongeveer 80% van de samenvloeiing is bereikt. Induceer vervolgens met één microliter doxycycline gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en houd ook alle cellen zonder doxycycline als controles voor dezelfde periode.Om verschillende luminescentie-intensiteiten te kwantificeren en te vergelijken, gebruikt u de dual luciferase reporter assay kit. Voordat u met de test begint, ontdooit u luciferase-assay-oplossingen en laat u ze bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens de mix Stop en Glo door 200 microliter van het substraat te mengen in 10 milliliter luciferasetestbuffer twee.Meng vervolgens 10 milliliter luciferasetestbuffer twee in het amber gemene luciferase-assaysubstraat twee om de mix, LAR II, voor te bereiden en goed te schudden. Breng daarna de oplossingen over naar centrifugebuizen van 15 milliliter die eerder zijn geïdentificeerd en beschermd tegen licht. Voer vervolgens de luminescentiemetingen uit met behulp van apparatuur zoals Synergy en meet uitgedrukt luciferase als relatieve lichteenheden en exporteer vervolgens de resultaten naar een spreadsheet voor verdere statistische analyse.Voer normalisatie van firefly luciferase-activiteit uit door de controle Renilla en plot dat als relatieve lichteenheden in een grafiek terwijl u herhaalt voor groepen met en zonder doxycycline-inductie. Overexpressie van HuR bij transfectie van pFLAG-HuR werd bevestigd in HeLa, BCPAP en HEK293T cellijn, en er werd waargenomen dat HuR-overexpressie in deze cellen de expressie van miR19A stimuleert. Een sterke vermindering van luciferaseactiviteit werd waargenomen met RAB1B 3'UTR bij verhoogde miR19A- en miR19B-expressie van pRD miR 17-92, in vergelijking met HeLa-Cre-cellen.De transfectie van pFLAG-HuR in HeLa-cellen veranderde de luciferase-activiteit niet. Overexpressie van HuR, in combinatie met doxycycline-suppletie die de expressie van de miR 17-92-cluster stimuleert, verminderde echter de luciferase-activiteit verder. Na bevestiging van de rol van het RNA-bindende eiwit in microRNA-rijping, zullen celkinetiek en celcyclusanalyse belangrijk zijn om de belangrijkste veranderingen te begrijpen die door het eiwit in microRNA's worden bevorderd.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Author Spotlight: Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay  

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Pharmacological Targeting of Ion Channels to Treat Solid Tumors

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Author Spotlight: Exploring the Role of Ion Channels in Cancer: Characterization and Potential Treatment Approaches 

Screening van ionkanalen in kankercellen

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...