Name: a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

Die Autoren danken E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapur) für die HeLa-Cre-Zellen und pRD-RIPE- und pCAGGS-Cre-Plasmide. Wir danken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes und Anselmo Moriscot für ihre Unterstützung.

Eine Übersicht über das hier beschriebene Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Plasmidaufbau
<ol><li>pCAGGS-Cre: Dieses Plasmid wurde von Dr. E. Makeyev21 zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplifizieren Sie pre-miR-17-92 durch PCR unter Verwendung von 0,5 μM jedes spezifischen Primers (Table of Materials), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-Puffer und 5 U High-Fidelity-T...

<ol>
	<li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+by+the+spliceosome.">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+structure+and+function.">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome.">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li><li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+devices+of+the+spliceosome:+Motors,+clocks,+springs,+and+things.">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability.">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li><li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing.">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li><li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antigen+R+(HuR)+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer.">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li><li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons:+MicroRNA+biogenesis+via+splicing.">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li><li>Michlewski, G., C&#225;ceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis.">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons,+an+emerging+class+of+atypical+miRNA.">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li><li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m(6)A-dependent+nuclear+RNA+processing+events.">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li><li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells.">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92.">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes &amp; Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells.">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li><li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins.">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs.">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438 (2016).</li><li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon.">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).</li><li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+HuR+function.">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis.">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth.">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li><li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation.">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li><li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells.">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li></ol>

Das Pre-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression, und seine Kontrolle kann starke Auswirkungen auf die phänotypischen Modifikationen der Zellen auslösen22,23. Mehr als 70% der miRNAs werden von Introns beim Menschen transkribiert, und wir stellten die Hypothese auf, dass ihre Verarbeitung und Reifung durch Spleißen regulatorischer Proteine erleichtert werden könnte24,25...

Das Vorläufer-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten1. Die Entfernung von Introns und die Vereinigung von Exons in reifer RNA wird durch das Spleißosom katalysiert, einen 2-Megadalton-Ribonukleoproteinkomplex, der aus 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 und U6) zusammen mit mehr als 100 Proteinen 2,3 besteht. Die Spleißreaktion erfolgt kotranskriptionell, und das Spleißosom wird an jedem neuen Intron zusammengesetzt, geleitet durch die Erkennung konservierter Spleißstellen an Exon-Intron-Grenzen und innerhalb des Introns4. Verschiedene Introns können trotz der bemerkenswerten Erhaltung des Spleißosomenkomplexes und seiner Komponenten unterschiedliche Spleißraten aufweisen. Zusätzlich zu den Unterschieden in der Konservierung von Spleißstellen können regulatorische Sequenzen, die auf Introns und Exons verteilt sind, RNA-bindende Proteine (RBP) steuern und das Spleißen stimulieren oder unterdrücken 5,6. HuR ist ein ubiquitär exprimiertes RBP und ein wichtiger Faktor zur Kontrolle der mRNA-Stabilität7. Frühere Ergebnisse unserer Gruppe zeigten, dass HuR an Introns binden kann, die miRNAs enthalten, was darauf hindeutet, dass dieses Protein ein wichtiger Faktor sein könnte, um die miRNA-Verarbeitung und -Reifung zu erleichtern, was auch zur Erzeugung alternativer Spleißisoformenführt 6,8,9.
Viele microRNAs (miRNAs) werden aus intronischen Sequenzen kodiert. Während einige Teil des Introns sind, sind andere als "Mirtrons" bekannt und werden vom gesamten Intron10,11 gebildet. miRNAs sind kurze nicht-kodierende RNAs mit 18 bis 24 Nukleotiden der Länge12. Ihre ausgereifte Sequenz zeigt eine teilweise oder vollständige Komplementarität mit Zielsequenzen in mRNAs, was sich auf die Translations- und/oder mRNA-Zerfallsraten auswirkt. Die Kombinationen von miRNAs und Targets treiben die Zelle zu unterschiedlichen Ergebnissen. Mehrere miRNAs können Zellen zu pro- oder antitumoralen Phänotypen treiben13. Onkogene miRNAs zielen in der Regel auf mRNAs ab, die eine suppressive Eigenschaft auslösen, was zu einer erhöhten Zellproliferation, Migration und Invasion führt14. Auf der anderen Seite könnten tumorsuppressive miRNAs auf onkogene mRNAs oder mRNAs abzielen, die mit einer erhöhten Zellproliferation zusammenhängen.
Auch die Verarbeitung und Reifung von miRNAs hängt von ihrer Herkunft ab. Die meisten intronischen miRNAs werden unter Beteiligung des Mikroprozessors verarbeitet, der aus der Ribonuklease Drosha und den Protein-Cofaktoren12 besteht. Mirtrons werden mit der Aktivität des Spleißosoms unabhängig von Drosha15 verarbeitet. In Anbetracht der hohen Häufigkeit von miRNAs, die in Introns gefunden werden, stellten wir die Hypothese auf, dass RNA-bindende Proteine, die am Spleißen beteiligt sind, auch die Verarbeitung und Reifung dieser miRNAs erleichtern könnten. Bemerkenswerterweise wurde das RBP hnRNP A2/B1 bereits mit dem Mikroprozessor und der miRNA-Biogeneseassoziiert 16. 
Wir haben bereits berichtet, dass mehrere RNA-bindende Proteine, wie hnRNPs und HuR, durch Massenspektrometrie mit intronischen miRNAs assoziiert sind17. Die Assoziation von HuR (ELAVL1) mit miRNAs aus dem intronischen Cluster miR-17-92 wurde mittels Immunpräzipitation und In-silico-Analyse bestätigt9. miR-17-92 ist ein intronischer miRNA-Cluster, der aus sechs miRNAs mit erhöhter Expression bei verschiedenen Krebsarten besteht18,19. Dieser Cluster wird auch als "oncomiR-1" bezeichnet und besteht aus miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b und miR-92 a. miR-19 a und miR-19b gehören zu den onkogensten miRNAs dieses Clusters 19. Die erhöhte Expression von HuR stimuliert die miR-19a- und miR-19b-Synthese 9. Da intronische Regionen, die diesen Cluster flankieren, mit HuR assoziiert sind, haben wir eine Methode entwickelt, um zu untersuchen, ob dieses Protein die Expression und Reifung von miR-19a und miR-19b regulieren kann. Eine wichtige Vorhersage unserer Hypothese war, dass HuR als regulatorisches Protein die miRNA-Biogenese erleichtern könnte, was zu phänotypischen Veränderungen führt. Eine Möglichkeit war, dass miRNAs durch die Stimulation von HuR verarbeitet wurden, aber nicht ausgereift und funktionsfähig wären und daher die Auswirkungen des Proteins den Phänotyp nicht direkt beeinflussen würden. Daher haben wir einen Spleißreporter-Assay entwickelt, um zu untersuchen, ob ein RBP wie HuR die Biogenese und Reifung einer intronischen miRNA beeinflussen könnte. Durch die Bestätigung der miRNA-Prozessierung und -Reifung zeigt unser Assay die Interaktion mit der Zielsequenz und die Erzeugung einer reifen und funktionellen miRNA. In unserem Assay koppeln wir die Expression eines intronischen miRNA-Clusters mit einem Luciferase-Plasmid, um die miRNA-Target-Bindung in kultivierten Zellen zu überprüfen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-RAP-IB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-miR-17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-RIPE-donor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK-Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HuR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>mAb&#160;12582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/high-glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB719150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E859-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV&#8482;-3 Expression Vector</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10966-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiR-GLO</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse OUT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>752899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol-LS reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/EDTA 10X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R616A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG 
			CTACTATATCAGTTTGCACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA 
			GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT 
			GGTTATGAAGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG 
			GGACTTGTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG 
			GGATTATGCTGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG 
			TACATTTAACAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA 
			GAATAATGTCAAAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC 
			TCAACAGGCCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8 for Mac OS X</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze RNA-Moleküle, die in Eukaryoten weit verbreitet sind. Die meisten miRNAs werden von Introns transkribiert, und ihre Reifung umfasst verschiedene RNA-bindende Proteine im Zellkern. Reife miRNAs vermitteln häufig Gen-Silencing, und dies ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um posttranskriptionelle Ereignisse zu verstehen. Darüber hinaus kann es als vielversprechende Methodik für Gentherapien erforscht werden. Derzeit fehlen jedoch direkte Methoden zur Beurteilung der miRNA-Expression in Säugetierzellkulturen. Hier beschreiben wir eine effiziente und einfache Methode, die bei der Bestimmung der miRNA-Biogenese und -Reifung durch Bestätigung ihrer Interaktion mit Zielsequenzen hilft. Dieses System ermöglicht auch die Trennung der exogenen miRNA-Reifung von ihrer endogenen Aktivität unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren Promotors, der in der Lage ist, die primäre miRNA (pri-miRNA) -Transkription mit hoher Effizienz und niedrigen Kosten zu steuern. Dieses Werkzeug ermöglicht auch die Modulation mit RNA-bindenden Proteinen in einem separaten Plasmid. Neben der Verwendung mit einer Vielzahl verschiedener miRNAs und ihren jeweiligen Targets kann es an verschiedene Zelllinien angepasst werden, sofern diese transfektionsfähig sind.

Unsere ursprüngliche Hypothese war, dass HuR die intronische miRNA-Biogenese erleichtern könnte, indem es an seine Prä-miRNA-Sequenz bindet. So könnte der Zusammenhang von HuR-Expression und miR-17-92-Clusterbiogenese auf einen neuen Mechanismus hinweisen, der die Reifung dieser miRNAs steuert. Die Überexpression von HuR bei Transfektion von pFLAG-HuR wurde in drei verschiedenen Zelllinien bestätigt: HeLa, BCPAP und HEK-293T (Abbildung 2). Als Kontrollen wurden untransfizierte...

Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Unser Protokoll befasst sich mit den Auswirkungen regulatorischer RNA-bindender Proteine auf die microRNA-Biogenese und -Reifung direkt aus Zellkulturen. Die von uns beschriebene Methode kann mit gängigen Zellkulturreagenzien durchgeführt werden und ist relativ schnell. Diese Methode kann wichtig sein, um die phänotypischen Wirkungen von microRNAs und ihren Zielen in verschiedenen Arten von eukaryotischen Zellen zu untersuchen.Normale oder krankheitsähnliche Zellen können verwendet werden. Es ist wichtig, Zelllinien auszuwählen, die für die Transfektion geeignet sind, und geeignete Transfektions- und Induktionskontrollen durchzuführen, um die Veränderungen der Zielaffinität durch Luciferase-Aktivität zu beobachten. Um zu beginnen, halten Sie die Zellen in DMEM, hohe Glukose Ergänzung in 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten, kontrollierten Atmosphäre Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Um adhärente Zellen abzulösen, inkubieren Sie sie mit Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Um Transfektionen durchzuführen, mischen Sie 200 Nanogramm DNA und 1,25 Mikroliter Transfektionsreagenz in 100 Mikroliter des Kulturmediums und fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen mit den Transfektionsmischungen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius.Dann ersetzen Sie das Medium durch ein Medium, das 10% FBS enthält, und inkubieren Sie für weitere 24 Stunden, bevor Sie die Antibiotika zur Auswahl hinzufügen. Um pFLAG-HuR und MT-pFLAG in HeLa zu transfizieren, selektieren Sie Zellen, indem Sie die Konzentration von Geneticin von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf 1000 Mikrogramm pro Milliliter erhöhen, wodurch stabile Zelllinien erzeugt werden. Dann bestätigen Sie die Überexpression mit quantitativer PCR unter Verwendung spezifischer Primer für HuR-mRNA.Transfizieren Sie die Plasmide in HeLa-Cre-Zellen mit 40 Nanogramm pTK-Renilla, dann pRD miR 17-92, erzeugen HeLa-Cre miR 17-92 und selektieren Sie mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Dann transfiziert HeLa-Cre miR 17-92 mit pTK-Renilla und pmirGLO RAB1B 3'UTR oder pmirGLO verschlüsselt 1B 3'UTR separat. Als nächstes wählen Sie Penicillin und Streptomycin, was zur Erzeugung von Luc RAB1B und Luc Scrambled führt.Als nächstes transfizieren Sie die Zellen mit pFLAG-HuR oder MT-PFLAG, wie sie zuvor gezeigt haben. Fahren Sie mit der Zellkultur mit HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 verschlüsselt, HeLa-Cre miR 17-92 HuR und HeLa-Cre miR 1792 HuR Lock fort, bis etwa 80% der Konfluenz erreicht sind. Dann induzieren Sie mit einem Mikroliter Doxycyclin für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und halten Sie auch alle Zellen ohne Doxycyclin als Kontrollen für den gleichen Zeitraum.Um verschiedene Lumineszenzintensitäten zu quantifizieren und zu vergleichen, verwenden Sie das Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit. Vor Beginn des Assays Luciferase-Assay-Lösungen auftauen und bei Raumtemperatur belassen. Als nächstes bereiten Sie die Mischung Stop und Glo vor, indem Sie 200 Mikroliter des Substrats in 10 Milliliter Luciferase-Assay-Puffer zwei mischen.Mischen Sie dann 10 Milliliter Luciferase-Assay-Puffer zwei in das bernsteinfarbene Vile des Luciferase-Assay-Substrats zwei, um die Mischung LAR II vorzubereiten, und schütteln Sie sie gut. Anschließend werden die Lösungen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, die zuvor identifiziert und vor Licht geschützt wurden. Als nächstes führen Sie die Lumineszenzmessungen mit Geräten wie Synergy durch und messen die ausgedrückte Luciferase als relative Lichteinheiten und exportieren die Ergebnisse dann zur weiteren statistischen Analyse in eine Tabelle.Führen Sie eine Normalisierung der Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität durch die Steuerung Renilla durch und zeichnen Sie diese als relative Lichteinheiten in einer Grafik auf, während Sie für Gruppen mit und ohne Doxycyclin-Induktion wiederholen. Die Überexpression von HuR bei Transfektion von pFLAG-HuR wurde in HeLa-, BCPAP- und HEK293T-Zelllinien bestätigt, und es wurde beobachtet, dass die HuR-Überexpression in diesen Zellen die Expression von miR19A stimuliert. Eine starke Verringerung der Luciferase-Aktivität wurde mit RAB1B 3'UTR bei erhöhter miR19A- und miR19B-Expression von pRD miR 17-92 im Vergleich zu HeLa-Cre-Zellen beobachtet.Die Transfektion von pFLAG-HuR in HeLa-Zellen veränderte die Luciferase-Aktivität nicht. Die Überexpression von HuR, gekoppelt mit einer Doxycyclin-Supplementierung, die die Expression des miR-17-92-Clusters stimulierte, reduzierte jedoch die Luciferase-Aktivität weiter. Nach der Bestätigung der Rolle des RNA-bindenden Proteins bei der microRNA-Reifung werden Zellkinetik und Zellzyklusanalyse wichtig sein, um die wichtigsten Veränderungen zu verstehen, die durch das Protein in microRNAs gefördert werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Forschung

Krebsforschung

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays  

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...