Name: a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

Os autores são gratos a E. Makeyev (Nanyang Technology University, Cingapura) pelas células HeLa-Cre e plasmídeos pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Agradecemos o apoio de Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot.

Uma visão geral do protocolo descrito aqui é retratada na Figura 1.
1. Construção plasmid
<ol><li>pCAGGS-Cre: Este plasmídeo foi fornecido pelo Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplie pré-miR-17-92 por PCR usando 0,5 μM de cada primer específico (Tabela de Materiais), 150 ng de cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampão PCR Taq e 5 U de polimerase de DNA Taq de alta fidelidade. Realize...

<ol>
	<li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+by+the+spliceosome.">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+structure+and+function.">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome.">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li><li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+devices+of+the+spliceosome:+Motors,+clocks,+springs,+and+things.">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability.">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li><li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing.">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li><li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antigen+R+(HuR)+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer.">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li><li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons:+MicroRNA+biogenesis+via+splicing.">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li><li>Michlewski, G., C&#225;ceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis.">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons,+an+emerging+class+of+atypical+miRNA.">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li><li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m(6)A-dependent+nuclear+RNA+processing+events.">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li><li>Paiva, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells.">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92.">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes &amp; Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells.">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li><li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins.">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs.">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438 (2016).</li><li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon.">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).</li><li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+HuR+function.">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis.">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth.">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li><li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation.">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li><li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells.">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li></ol>

O emenda pré-mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética, e seu controle pode desencadear efeitos fortes sobre modificações fenotípicascelulares 22,23. Mais de 70% dos miRNAs são transcritos de introns em humanos, e nós imaginamos que seu processamento e maturação poderiam ser facilitados por emendar proteínas regulatórias24,25. Desenvolvemos um método para analisa...

O splicing precursor de mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética em eucariotes1. A remoção de introns e a união de exons em RNA maduro é catalisada pelo emendatoroso, um complexo de 2 megadalton ribonucleoproteína composto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) juntamente com mais de 100 proteínas 2,3. A reação de emenda ocorre co-transcrição, e o emendamento é montado a cada novo intron guiado pelo reconhecimento de locais de emenda conservados nos limites exon-intron e dentro do intron4. Diferentes introns podem ter diferentes taxas de emenda, apesar da notável conservação do complexo de emendas e seus componentes. Além das diferenças na conservação do local de emenda, as sequências regulatórias distribuídas em introns e exons podem guiar proteínas de ligação de RNA (RBP) e estimular ou reprimiro splicing 5,6. HuR é um RBP onipresentemente expresso e é um fator importante para controlar a estabilidade do mRNA7. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o HuR pode se ligar a introns contendo miRNAs, indicando que essa proteína pode ser um fator importante para facilitar o processamento e a maturação do miRNA, levando também à geração de isóformes alternativos de emenda 6,8,9.
Muitas microRNAs (miRNAs) são codificadas a partir de sequências intrônicas. Enquanto alguns fazem parte do intron, outros são conhecidos como "mirtrons" e são formados por todo o intron10,11. miRNAs são RNAs curtas sem codificação, variando de 18 a 24 nucleotídeos no comprimento12. Sua sequência madura mostra complementaridade parcial ou total com sequências de destino em mRNAs, afetando, portanto, taxas de decadência de tradução e/ou mRNA. As combinações de miRNAs e alvos levam a célula a diferentes resultados. Vários miRNAs podem conduzir células para fenótipos pró ou anti-tumorais13. MiRNAs oncogênicas geralmente têm como alvo mRNAs que desencadeiam uma característica supressiva, levando ao aumento da proliferação celular, migração e invasão14. Por outro lado, miRNAs supressivas de tumores podem atingir mRNAs oncogênicas ou mRNAs relacionados ao aumento da proliferação celular.
O processamento e o amadurecimento das miRNAs também dependem de sua origem. A maioria dos miRNAs intrônicos são processados com a participação do microprocessador, formado pela ribonuclease Drosha e cofatores proteicos12. Mirtrons são processados com a atividade do emendarosome independentemente de Drosha15. Considerando a alta frequência de miRNAs encontradas dentro dos introns, imaginamos que as proteínas de ligação de RNA envolvidas com o splicing também poderiam facilitar o processamento e a maturação desses miRNAs. Notavelmente, o RBP hnRNP A2/B1 já foi associado com o microprocessador e a biogênese miRNA16. 
Já relatamos anteriormente que várias proteínas de ligação de RNA, como hnRNPs e HuR, estão associadas a miRNAs intrônicas por espectrometria de massa17. A associação de HuR (ELAVL1) com miRNAs do cluster tronic miR-17-92 foi confirmada por meio de imunoprecipitação e na análise de silico 9. miR-17-92 é um cluster miRNA intrônico composto por seis miRNAs com expressão aumentada em diferentes cânceres18,19. Este cluster também é conhecido como "oncomiR-1" e é composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b, e miR-92a. miR-19a e miR-19b estão entre os miRNAs mais oncogênicos deste cluster19. O aumento da expressão do HuR estimula a síntese miR-19a e miR-19b 9. Uma vez que as regiões intrônicas que flanqueiam este aglomerado estão associadas ao HuR, desenvolvemos um método para investigar se essa proteína poderia regular a expressão e a maturação de miR-19b. Uma previsão importante de nossa hipótese foi que, como proteína regulatória, o HuR poderia facilitar a biogênese do miRNA, levando a alterações fenotípicas. Uma possibilidade era que os miRNAs fossem processados pela estimulação do HuR, mas não seriam maduros e funcionais e, portanto, os efeitos da proteína não impactariam diretamente o fenótipo. Por isso, desenvolvemos um ensaio de repórter emenda para investigar se um RBP como o HuR poderia afetar a biogênese e o amadurecimento de um miRNA intronic. Ao confirmar o processamento e amadurecimento do miRNA, nosso ensaio mostra a interação com a sequência de destino e a geração de um miRNA maduro e funcional. Em nosso ensaio, acoplamos a expressão de um aglomerado de miRNA intrônico com um plasmídeo de luciferase para verificar se há ligação de alvo de miRNA em células cultivadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-RAP-IB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-miR-17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-RIPE-donor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK-Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HuR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>mAb&#160;12582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/high-glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB719150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E859-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV&#8482;-3 Expression Vector</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10966-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiR-GLO</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse OUT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>752899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol-LS reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/EDTA 10X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R616A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG 
			CTACTATATCAGTTTGCACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA 
			GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT 
			GGTTATGAAGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG 
			GGACTTGTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG 
			GGATTATGCTGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG 
			TACATTTAACAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA 
			GAATAATGTCAAAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC 
			TCAACAGGCCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8 for Mac OS X</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA curtas que são difundidas em eucariotes. A maioria dos miRNAs são transcritas de introns, e sua maturação envolve diferentes proteínas de ligação de RNA no núcleo. MiRNAs maduras frequentemente mediam o silenciamento genético, e isso se tornou uma ferramenta importante para compreender eventos pós-transcrição. Além disso, pode ser explorado como uma metodologia promissora para terapias genéticas. No entanto, atualmente há uma falta de métodos diretos para avaliar a expressão miRNA em culturas de células mamíferas. Aqui, descrevemos um método eficiente e simples que auxilia na determinação da biogênese e maturação do miRNA através da confirmação de sua interação com sequências de destino. Além disso, este sistema permite a separação da maturação exógena do miRNA de sua atividade endógena usando um promotor indutível de doxiciclina capaz de controlar a transcrição miRNA primária (pri-miRNA) com alta eficiência e baixo custo. Esta ferramenta também permite a modulação com proteínas de ligação de RNA em um plasmídeo separado. Além de seu uso com uma variedade de diferentes miRNAs e seus respectivos alvos, ele pode ser adaptado a diferentes linhas celulares, desde que sejam favoráveis à transfecção.

Nossa hipótese inicial era que o HuR poderia facilitar a biogênese miRNA intronic, vinculando-se à sua sequência pré-miRNA. Assim, a conexão da expressão HuR e da biogênese de cluster miR-17-92 poderia apontar para um novo mecanismo que rege o amadurecimento desses miRNAs. A superexpressão do HuR após a transfecção do pFLAG-HuR foi confirmada em três linhas celulares diferentes: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Como controles, foram utilizadas células não traduzída...

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A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Nosso protocolo aborda os efeitos das proteínas reguladoras de ligação de RNA na biogênese e maturação de microRNA, diretamente das culturas celulares. O método que descrevemos pode ser realizado com reagentes de cultura celular comum e é relativamente rápido. Este método pode ser importante para estudar os efeitos fenotípicos das microRNAs e seus alvos em diferentes tipos de células eucarióticas.Células normais ou semelhantes a doenças podem ser usadas. É importante escolher linhas celulares favoráveis à transfecção, realizar controles adequados de transfecção e indução, a fim de observar as mudanças na afinidade alvo através da atividade luciferase. Para começar, mantenha as células em DMEM, suplemento de alta glicose em placas de Petri de 100 milímetros e incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora atmosférica úmida e controlada com 5% de dióxido de carbono.Para desapegar células aderentes, incuba-as com a solução trypsin-EDTA a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Para realizar transfeções, misture 200 nanogramas de DNA e 1,25 microlitres de reagente transfecção em 100 microliters do meio de cultura e adicione a mistura de transfecção às células. Em seguida, incubar as células com as misturas de transfecção por quatro horas a 37 graus Celsius.Em seguida, substitua o meio por meio contendo 10% FBS e incubar por mais 24 horas antes de adicionar os antibióticos para seleção. Para transfetar pFLAG-HuR e MT-pFLAG em HeLa, selecione células aumentando a concentração de Geneticin de 100 microgramas por mililitro para 1000 microgramas por mililitro, gerando linhas celulares estáveis. Em seguida, confirme a superexpressão com PCR quantitativo usando primers específicos para HuR mRNA.Transfeito os plasmídeos em células HeLa-Cre com 40 nanogramas pTK-Renilla, depois pRD miR 17-92, gerando HeLa-Cre miR 17-92, e selecionando com um micrograma por mililitro puromycina. Em seguida, transfect HeLa-Cre miR 17-92 com pTK-Renilla e pmirGLO RAB1B 3'UTR ou pmirGLO mexido 1B 3'UTR separadamente. Em seguida, selecione usando penicilina e estreptomicina, resultando na geração de luc RAB1B e luc mexido.Em seguida, transfete as células com pFLAG-HuR ou MT-PFLAG como elas demonstraram anteriormente. Prossiga para a cultura celular com HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 mexido, HeLa-Cre miR 17-92 HuR, e HeLa-Cre miR 1792 HuR bloqueio até que aproximadamente 80% de confluência é alcançado. Em seguida, induz com um microliter de doxiciclina por 30 minutos a 37 graus Celsius e também mantenha todas as células sem doxiciclina como controles para o mesmo período.Para quantificar e comparar diferentes intensidades de luminescência, use o kit de ensaio de repórter de luciferase dupla. Antes de iniciar o ensaio, descongele as soluções de ensaio de luciferase e deixe-as em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a mistura Stop e Glo misturando 200 microliters do substrato em 10 mililitros de amortecedor de ensaio luciferase dois.Em seguida, misture 10 mililitros de tampão de ensaio de luciferase dois no vile âmbar do substrato de ensaio de luciferase dois para preparar a mistura, LAR II, e agitar bem. Posteriormente, transfira as soluções para tubos de centrífugas de 15 mililitros previamente identificados e protegidos contra a luz. Em seguida, realize as leituras de luminescência utilizando equipamentos como Sinergia e meça luciferase expressa como unidades de luz relativa, e, em seguida, exporte os resultados para uma planilha para análise estatística posterior.Realize a normalização da atividade de luciferase de vagalume pelo controle Renilla e plote isso como unidades de luz relativas em um gráfico enquanto se repete para grupos com e sem indução de doxiciclina. A superexpressão do HuR após a transfecção de pFLAG-HuR foi confirmada na linha celular HeLa, BCPAP e HEK293T, e observou-se que a superexpressão do HuR nessas células estimula a expressão do miR19A. Observou-se forte redução da atividade da luciferase com a expressão RAB1B 3'UTR sobre o aumento da expressão miR19A e miR19B de pRD miR 17-92, em comparação com as células HeLa-Cre.A transfecção de pFLAG-HuR em células HeLa não alterou a atividade da luciferase. No entanto, a superexpressão do HuR, juntamente com a suplementação de doxiciclina estimulando a expressão do cluster miR 17-92, reduziu ainda mais a atividade da luciferase. Após a confirmação do papel da proteína de ligação de RNA na maturação do microRNA, a cinética celular e a análise do ciclo celular serão importantes para entender as principais mudanças promovidas pela proteína nos microRNAs.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Pesquisa do câncer

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Author Spotlight: Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay  

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

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Pharmacological Targeting of Ion Channels to Treat Solid Tumors

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Author Spotlight: Exploring the Role of Ion Channels in Cancer: Characterization and Potential Treatment Approaches 

Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...