Name: a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

Yazarlar, HeLa-Cre hücreleri ve pRD-RIPE ve pCAGGS-Cre plazmidleri için E. Makeyev'e (Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur) minnettardır. Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes ve Anselmo Moriscot'a destekleri için teşekkür ederiz.

Burada açıklanan protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Plazmid yapımı
<ol><li>pCAGGS-Cre: Bu plazmid Dr. E. Makeyev21 tarafından sağlanmıştır.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Pre-miR-17-92'yi, her bir spesifik astarın 0.5 μM'sini (Malzeme Tablosu), 150 ng cDNA, 1 mM dNTP'ler, 1x Taq PCR tamponu ve 5 U yüksek doğruluklu Taq DNA polimeraz kullanarak PCR ile yüks...

<ol>
	<li>Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing+by+the+spliceosome.">RNA splicing by the spliceosome.</a> Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+structure+and+function.">Spliceosome structure and function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+the+human+spliceosome.">An atomic structure of the human spliceosome.</a> Cell. 169 (5), 918-929 (2017).</li><li>Staley, J. P., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+devices+of+the+spliceosome:+Motors,+clocks,+springs,+and+things.">Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things.</a> Cell. 92 (3), 315-326 (1998).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements.">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).</li><li>Mukherjee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+regulatory+mapping+indicates+that+the+RNA-binding+protein+HuR+couples+pre-mRNA+processing+and+mRNA+stability.">Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability.</a> Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).</li><li>Pandit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+SR+protein+cooperation+and+competition+in+regulated+splicing.">Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing.</a> Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).</li><li>Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antigen+R+(HuR)+facilitates+miR-19+synthesis+and+affects+cellular+kinetics+in+papillary+thyroid+cancer.">Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).</li><li>Westholm, J. O., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons:+MicroRNA+biogenesis+via+splicing.">Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing.</a> Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).</li><li>Michlewski, G., C&#225;ceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+miRNA+biogenesis.">Post-transcriptional control of miRNA biogenesis.</a> RNA. 25 (1), 1-16 (2019).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+MicroRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirtrons,+an+emerging+class+of+atypical+miRNA.">Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).</li><li>Alarcon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNRNPA2B1+is+a+mediator+of+m(6)A-dependent+nuclear+RNA+processing+events.">HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events.</a> Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).</li><li>Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR18a+and+miR19a+recruit+specific+proteins+for+splicing+in+thyroid+cancer+cells.">miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Olive, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19+is+a+key+oncogenic+component+of+mir-17-92.">miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92.</a> Genes &amp; Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+platform+for+short+hairpin+RNA+interference+and+transgenesis+in+cultured+mammalian+cells.">Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).</li><li>Huelga, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genome-wide+analysis+reveals+cooperative+regulation+of+alternative+splicing+by+hnRNP+proteins.">Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins.</a> Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).</li><li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2/ASF+is+a+proto-oncogene.">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).</li><li>Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+gene+constraints+and+genomic+context+impact+the+expression+and+evolution+of+human+microRNAs.">Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11438 (2016).</li><li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon.">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).</li><li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+HuR+function.">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis.">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth.">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li><li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation.">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li><li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells.">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li></ol>

Pre-mRNA ekleme, gen ekspresyon regülasyonu için önemli bir süreçtir ve kontrolü, hücre fenotipik modifikasyonları üzerinde güçlü etkileri tetikleyebilir22,23. MiRNA'ların% 70'inden fazlası insanlardaki intronlardan kopyalanır ve bunların işlenmesinin ve olgunlaşmasının, düzenleyici proteinlerin24,25 eklenmesiyle kolaylaştırılabileceğini varsaydık. Kültürlü hücrelerde introni...

Prekürsör mRNA ekleme, ökaryotlarda gen ekspresyonu regülasyonu için önemli bir süreçtir1. İntronların çıkarılması ve olgun RNA'daki ekzonların birleşmesi, 5 snRNA'dan (U1, U2, U4, U5 ve U6) oluşan 2 megadalton ribonükleoprotein kompleksi olan splisozom ve 100'den fazla protein 2,3 tarafından katalize edilir. Ekleme reaksiyonu ko-transkripsiyonel olarak gerçekleşir ve splisozom, ekzon-intron sınırlarında ve intron4 içinde korunmuş ekleme bölgelerinin tanınmasıyla yönlendirilen her yeni intronda birleştirilir. Farklı intronlar, splisozom kompleksinin ve bileşenlerinin dikkate değer korunumuna rağmen farklı ekleme oranlarına sahip olabilir. Ekleme bölgesi korunumundaki farklılıklara ek olarak, intronlar ve ekzonlar üzerine dağıtılan düzenleyici diziler, RNA bağlayıcı proteinleri (RBP) yönlendirebilir ve ekleme 5,6'yı uyarabilir veya bastırabilir. HuR, her yerde eksprese edilen bir RBP'dir ve mRNA stabilitesini kontrol etmek için önemli bir faktördür7. Grubumuzdan elde edilen önceki sonuçlar, HuR'nin miRNA'lar içeren intronlara bağlanabildiğini gösterdi, bu da bu proteinin miRNA işlemesini ve olgunlaşmasını kolaylaştırmak için önemli bir faktör olabileceğini ve ayrıca alternatif ekleme izoformlarının 6,8,9 oluşumuna yol açabileceğini gösterdi.
Birçok mikroRNA (miRNA) intronik dizilerden kodlanır. Bazıları intron'un bir parçası iken, diğerleri "mirtronlar" olarak bilinir ve tüm intron10,11 tarafından oluşturulur. miRNA'lar, uzunluğu12 olan 18 ila 24 nükleotid arasında değişen kısa kodlamayan RNA'lardır. Olgun dizileri, mRNA'lardaki hedef dizilerle kısmi veya tam tamamlayıcılık gösterir, bu nedenle translasyon ve / veya mRNA bozunma oranlarını etkiler. MiRNA'ların ve hedeflerin kombinasyonları hücreyi farklı sonuçlara götürür. Birkaç miRNA, hücreleri pro- veya anti-tümöral fenotiplere yönlendirebilir13. Onkojenik miRNA'lar genellikle baskılayıcı bir özelliği tetikleyen mRNA'ları hedef alır ve bu da hücresel proliferasyon, göç ve invazyonun artmasına neden olur14. Öte yandan, tümör baskılayıcı miRNA'lar, onkojenik mRNA'ları veya artmış hücre proliferasyonuna bağlı mRNA'ları hedefleyebilir.
MiRNA'ların işlenmesi ve olgunlaşması da kökenlerine bağlıdır. Çoğu intronic miRNA, ribonükleaz Drisha ve protein ko-faktörleri12 tarafından oluşturulan mikroişlemcinin katılımıyla işlenir. Mirtronlar, Drosha15'ten bağımsız olarak splisozomun aktivitesi ile işlenir. İntronlarda bulunan miRNA'ların yüksek frekansını göz önünde bulundurarak, ekleme ile ilgili RNA bağlayıcı proteinlerin bu miRNA'ların işlenmesini ve olgunlaşmasını da kolaylaştırabileceğini varsaydık. Özellikle, RBP hnRNP A2 / B1 zaten mikroişlemci ve miRNA biyogenezi16 ile ilişkilendirilmiştir. 
Daha önce hnRNP'ler ve HuR gibi birkaç RNA bağlayıcı proteinin, kütle spektrometrisi17 ile intronic miRNA'larla ilişkili olduğunu bildirmiştik. HuR'un (ELAVL1) miR-17-92 intronik kümesinden miRNA'larla ilişkisi, immünopresipitasyon ve in siliko analizi9 kullanılarak doğrulandı. miR-17-92, farklı kanserlerde ekspresyonu artmış altı miRNA'dan oluşan bir intronik miRNA kümesidir18,19. Bu küme aynı zamanda "oncomiR-1" olarak da bilinir ve miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19b ve miR-92 a'dan oluşur. miR-19 a ve miR-19b, bu küme 19'un en onkojenik miRNA'larıarasındadır. HuR'nin artan ekspresyonu miR-19a ve miR-19b sentezi 9'u uyarır. Bu kümeyi çevreleyen tronik bölgeler HuR ile ilişkili olduğundan, bu proteinin miR-19a ve miR-19b ekspresyonunu ve olgunlaşmasını düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırmak için bir yöntem geliştirdik. Hipotezimizin önemli bir tahmini, düzenleyici bir protein olarak HuR'nin miRNA biyogenezini kolaylaştırabileceği ve fenotipik değişikliklere yol açabileceğiydi. Bir olasılık, miRNA'ların HuR'nin uyarılmasıyla işlendiği, ancak olgun ve işlevsel olmayacağı ve bu nedenle proteinin etkilerinin fenotipi doğrudan etkilemeyeceğiydi. Bu nedenle, HuR gibi bir RBP'nin intronic bir miRNA'nın biyogenezini ve olgunlaşmasını etkileyip etkilemediğini araştırmak için bir ekleme muhabiri testi geliştirdik. MiRNA işlemeyi ve olgunlaşmasını doğrulayarak, tahlilimiz hedef sekans ile etkileşimi ve olgun ve fonksiyonel bir miRNA'nın oluşumunu gösterir. Tahlilimizde, kültürlenmiş hücrelerde miRNA hedef bağlanmasını kontrol etmek için bir intronic miRNA kümesinin ekspresyonunu bir lusiferaz plazmidi ile birleştiriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-RAP-IB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiRGLO-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-miR-17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRD-RIPE-donor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTK-Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HuR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>mAb&#160;12582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td>929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated during this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/high-glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>MB719150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E859-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV&#8482;-3 Expression Vector</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-T</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10966-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmiR-GLO</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse OUT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>752899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol-LS reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/EDTA 10X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R616A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG 
			CTACTATATCAGTTTGCACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA 
			GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse scrambled pmiRGLO</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT 
			AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT 
			GGTTATGAAGAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR pFLAG</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG 
			GGACTTGTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG 
			GGATTATGCTGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG 
			TACATTTAACAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse B-Actin qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse HuR qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA 
			GAATAATGTCAAAGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td>
			<td>Exxtend</td>
			<td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC 
			TCAACAGGCCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8 for Mac OS X</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter assay to analyze intronic microrna maturation in mammalian cells

MikroRNA'lar (miRNA'lar) ökaryotlarda yaygın olan kısa RNA molekülleridir. Çoğu miRNA intronlardan kopyalanır ve olgunlaşmaları çekirdekte farklı RNA bağlayıcı proteinleri içerir. Olgun miRNA'lar sıklıkla gen susturmaya aracılık eder ve bu, transkripsiyon sonrası olayları anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, gen terapileri için umut verici bir metodoloji olarak araştırılabilir. Bununla birlikte, şu anda memeli hücre kültürlerinde miRNA ekspresyonunu değerlendirmek için doğrudan yöntemlerin eksikliği vardır. Burada, miRNA biyogenezinin ve olgunlaşmanın belirlenmesinde, hedef dizilerle etkileşiminin doğrulanması yoluyla yardımcı olan etkili ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bu sistem, birincil miRNA (pri-miRNA) transkripsiyonunu yüksek verimlilik ve düşük maliyetle kontrol edebilen bir doksisiklin ile indüklenebilir promotör kullanarak eksojen miRNA olgunlaşmasının endojen aktivitesinden ayrılmasını sağlar. Bu araç aynı zamanda ayrı bir plazmidde RNA bağlayıcı proteinlerle modülasyona izin verir. Çeşitli farklı miRNA'lar ve bunların ilgili hedefleriyle kullanımına ek olarak, transfeksiyona uygun olmaları koşuluyla farklı hücre hatlarına uyarlanabilir.

İlk hipotezimiz, HuR'nin pre-miRNA dizisine bağlanarak intronic miRNA biyogenezini kolaylaştırabileceğiydi. Bu nedenle, HuR ekspresyonu ve miR-17-92 küme biyogenezinin bağlantısı, bu miRNA'ların olgunlaşmasını yöneten yeni bir mekanizmaya işaret edebilir. pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu üzerine HuR'nin aşırı ekspresyonu üç farklı hücre hattında doğrulandı: HeLa, BCPAP ve HEK-293T (Şekil 2). Kontrol olarak, transfekte edilmemiş hücreler ve boş pFLAG vektör...

Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells at JoVE.com

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Protokolümüz, düzenleyici RNA bağlayıcı proteinlerin mikroRNA biyogenezi ve olgunlaşması üzerindeki etkilerini, doğrudan hücre kültürlerinden ele almaktadır. Tanımladığımız yöntem ortak hücre kültürü reaktifleri ile gerçekleştirilebilir ve nispeten hızlıdır. Bu yöntem, mikroRNA'ların fenotipik etkilerini ve farklı ökaryotik hücre tiplerindeki hedeflerini incelemek için önemli olabilir.Normal veya hastalık benzeri hücreler kullanılabilir. Lusiferaz aktivitesi yoluyla hedef afinitedeki değişiklikleri gözlemlemek için transfeksiyona uygun hücre hatlarının seçilmesi, yeterli transfeksiyon ve indüksiyon kontrollerinin yapılması önemlidir. Başlamak için, hücreleri DMEM'de tutun, 100 milimetre Petri kaplarında yüksek glikoz takviyesi yapın ve hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş, kontrollü bir atmosfer inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.Yapışkan hücreleri ayırmak için, üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede tripsin-EDTA çözeltisi ile inkübe edin. Transfeksiyonları gerçekleştirmek için, kültür ortamının 100 mikrolitresinde 200 nanogram DNA ve 1.25 mikrolitre transfeksiyon reaktifini karıştırın ve transfeksiyon karışımını hücrelere ekleyin. Daha sonra, hücreleri transfeksiyon karışımlarıyla 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.Daha sonra ortamı% 10 FBS içeren ortamla değiştirin ve seçim için antibiyotik eklemeden önce 24 saat daha inkübe edin. pFLAG-HuR ve MT-pFLAG'i HeLa'ya aktarmak için, Geneticin konsantrasyonunu mililitre başına 100 mikrogramdan mililitre başına 1000 mikrograma çıkararak hücreleri seçin ve kararlı hücre hatları oluşturun. Daha sonra, HuR mRNA için spesifik primerler kullanarak kantitatif PCR ile aşırı ekspresyonu onaylayın.HeLa-Cre hücrelerindeki plazmidleri 40 nanogram pTK-Renilla, daha sonra pRD miR 17-92 ile transfekte edin, HeLa-Cre miR 17-92 üretin ve mililitre puromisin başına bir mikrogram ile seçin. Daha sonra, pTK-Renilla ve pmirGLO RAB1B 3'UTR veya pmirGLO ile transfekt HeLa-Cre miR 17-92, 1B 3'UTR'yi ayrı ayrı karıştırdı. Ardından, penisilin ve streptomisin kullanarak seçin, bu da luc RAB1B ve luc karıştırılmış olarak üretilmesine neden olur.Daha sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi pFLAG-HuR veya MT-PFLAG ile aktarın. HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 karıştırılmış, HeLa-Cre miR 17-92 HuR ve HeLa-Cre miR 1792 HuR kilidi ile akıcılığın yaklaşık% 80'ine ulaşılana kadar hücre kültürüne geçin. Daha sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir mikrolitre doksisiklin ile indükleyin ve ayrıca tüm hücreleri aynı süre boyunca kontrol olarak doksisiklin olmadan tutun.Farklı lüminesans yoğunluklarını ölçmek ve karşılaştırmak için, çift lusiferaz muhabir tahlil kitini kullanın. Tahlil başlamadan önce, lusiferaz tahlil çözeltilerini çözün ve oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, 200 mikrolitre substratı 10 mililitre lusiferaz tahlil tamponu ikisinde karıştırarak Stop ve Glo karışımını hazırlayın.Daha sonra 10 mililitre lusiferaz testi tamponu ikiyi, karışımı hazırlamak için lusiferaz testi substratı iki'nin amber aşağılığına karıştırın ve iyice çalkalayın. Daha sonra, çözeltileri daha önce tanımlanmış ve ışıktan korunan 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, Sinerji gibi ekipmanları kullanarak lüminesans okumalarını gerçekleştirin ve ifade edilen lusiferazı göreceli ışık birimleri olarak ölçün ve ardından sonuçları daha fazla istatistiksel analiz için bir elektronik tabloya aktarın.Renilla kontrolü ile ateşböceği lusiferaz aktivitesinin normalleştirilmesini gerçekleştirin ve doksisiklin indüksiyonu olan ve olmayan gruplar için tekrarlarken bunu bir grafikte göreceli ışık birimleri olarak çizin. pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu üzerine HuR'nin aşırı ekspresyonu HeLa, BCPAP ve HEK293T hücre hattında doğrulandı ve bu hücrelerdeki HuR aşırı ekspresyonunun miR19A ekspresyonunu uyardığı gözlendi. HeLa-Cre hücrelerine kıyasla, pRD miR 17-92'den artmış miR19A ve miR19B ekspresyonu üzerine RAB1B 3'UTR ile lusiferaz aktivitesinde güçlü bir azalma gözlendi.HeLa hücrelerinde pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu lusiferaz aktivitesini değiştirmedi. Bununla birlikte, HuR'nin aşırı ekspresyonu, miR 17-92 kümesinin ekspresyonunu uyaran doksisiklin takviyesi ile birleştiğinde, lusiferaz aktivitesini daha da azaltmıştır. RNA bağlayıcı proteinin mikroRNA olgunlaşmasındaki rolünü doğruladıktan sonra, hücre kinetiği ve hücre döngüsü analizi, mikroRNA'larda protein tarafından teşvik edilen büyük değişiklikleri anlamak için önemli olacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Kanser Araştırmaları

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Author Spotlight: Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay  

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Pharmacological Targeting of Ion Channels to Treat Solid Tumors

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Author Spotlight: Exploring the Role of Ion Channels in Cancer: Characterization and Potential Treatment Approaches 

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...