Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة مستشفى تونغجي (HUST) للعلماء الشباب المتميزين (منحة رقم 2020YQ06).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة معهد رعاية الحيوان التابعة لكلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين.
1. المواد
<ol><li>قم بإعداد الحلول التالية قبل بدء البروتوكول.<ol>
<li>قم بإعداد مخزن التحميل المؤقت عن طريق إضافة مصل البق...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

يقترح البروتوكول طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم التقاطها باستخدام حبات CD11b نقاء عاليا وقابلية للحياة. وت?...

تنشأ الخلايا الدبقية الصغيرة من أسلاف كيس صفار البيض ، والتي تصل إلى الدماغ الجنيني في وقت مبكر جدا وتشارك في تطوير الجهاز العصبي المركزي 1,2. على سبيل المثال ، يشاركون في التقليم المشبكي3 وتنظيم النمو المحوري4. أنها تفرز العوامل التي تعزز بقاء الخلايا العصبية وتساعد على توطين الخلايا العصبية5. في الوقت نفسه ، يشاركون في إزالة الخلايا غير الطبيعية والخلايا الماصة لضمان نمو الدماغ الطبيعي6. بالإضافة إلى ذلك ، باعتبارها الخلايا المختصة بالمناعة في الدماغ ، تراقب الخلايا الدبقية الصغيرة باستمرار حمة الدماغ لإزالة الخلايا الميتة ، والمشابك العصبية المختلة وظيفيا ، والحطام الخلوي7. وقد ثبت أن تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة يلعب دورا مهما في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية، والأمراض العصبية التنكسية، وأورام الدماغ. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في التصلب المتعدد (MS) في تمايز خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) وتجديد المايلين عن طريق ابتلاع حطام المايلين8.
في مرض الزهايمر (AD) ، ينشط تراكم بيتا أميلويد (Aβ) الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يؤثر على وظائف البلعمة والالتهابات في الخلايا الدبقية الصغيرة9. يمكن للدبقية الصغيرة المنشطة في أنسجة الورم الدبقي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي (GAM) ، تنظيم تطور الورم الدبقي وتؤثر في النهاية على تشخيص المرضى10. يغير التنشيط بشكل عميق النسخ الدبقي الصغير ، مما يؤدي إلى تغيرات مورفولوجية ، والتعبير عن المستقبلات المناعية ، وزيادة نشاط البلعمة ، وتعزيز إفراز السيتوكين11. هناك مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الأمراض العصبية التنكسية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالمرض (DAM) ، والخلايا الدبقية الصغيرة ذات الاستجابة المنشطة (ARM) ، والنمط الظاهري العصبي التنكسي الدبقي الصغير (MGnD)8.
وبالمثل ، تتعايش مجموعات فرعية وظيفية ديناميكية متعددة من الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الدماغ في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية12. إن فهم عدم التجانس بين مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري للتحقيق في التسبب في أمراض إزالة الميالين الالتهابية وإيجاد استراتيجياتها العلاجية المحتملة. يعتمد عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية8. من الضروري وصف التغيرات الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة بدقة لدراسة عدم التجانس. وقد مكن التقدم في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (RNA-seq) من تحديد الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الحالات المرضية13. لذلك ، فإن القدرة على عزل مجموعات الخلايا أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحقيق في هذه الخلايا المستهدفة في ظل ظروف محددة.
الدراسات التي أجريت لفهم خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة عادة ما تكون في الدراسات المختبرية ، حيث وجد أنه يمكن تحضير أعداد كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية وزراعتها من أدمغة جرو الفئران (1-3 أيام) ، والتي ترتبط بقوارير الثقافة وتنمو على السطح البلاستيكي مع الخلايا الدبقية المختلطة الأخرى. في وقت لاحق ، يمكن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية بناء على الالتصاق المختلف للخلايا الدبقية المختلطة14,15. ومع ذلك ، يمكن لهذه الطريقة فقط عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة وتستغرق عدة أسابيع. قد تؤثر المتغيرات المحتملة في زراعة الخلايا على خصائص الخلايا الدبقية الدقيقة مثل التعبير الجزيئي16. علاوة على ذلك ، لا يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بهذه الطرق المشاركة إلا في التجارب المختبرية من خلال محاكاة ظروف أمراض الجهاز العصبي المركزي ولا يمكنها تمثيل خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في حالات مرض الجسم الحي. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الفأر البالغ.
فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) والفصل المغناطيسي هما طريقتان مستخدمتان على نطاق واسع ، على الرغم من أن لهما قيودهما المختلفة الخاصة16،17،18،19. وسيتم المقارنة بين مزاياها وعيوبها في قسم المناقشة. يوفر نضج تقنية MACS إمكانية تنقية الخلايا بسرعة. طور هوانغ وآخرون طريقة ملائمة لتسمية الآفات المزيل للميالين في الأدمغة20. من خلال الجمع بين هذين النهجين التقنيين ، نقترح بروتوكول فصل مغناطيسي عمودي CD11b سريع وفعال ، مما يوفر وصفا خطوة بخطوة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين في أدمغة الفئران البالغة والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كانت آفات إزالة الميالين البؤرية ناتجة عن الحقن التجسيمي ل 2 ميكرولتر من محلول الليسوليسيثين (1٪ LPC في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) في الجسم الثفني قبل 3 أيام من بدء البروتوكول21. يضع هذا البروتوكول الأساس لتنفيذ الخطوة التالية في التجارب المختبرية. علاوة على ذلك ، يوفر هذا البروتوكول الوقت ويظل ممكنا للاستخدام على نطاق واسع في التجارب المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الدماغ ، هي المستجيبين الأساسيين للالتهاب أو الإصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يمكن تقسيم الخلايا الدبقية الصغيرة إلى حالة راحة وحالة تنشيط ويمكن أن تتغير حالتها بسرعة استجابة للبيئة الدقيقة للدماغ. سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل ظروف مرضية مختلفة وتظهر أنماطا ظاهرية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وعدم التجانس الكبير بين المجموعات الفرعية المختلفة. يعتمد عدم التجانس بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كشفت الدراسات أنه سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتلعب دورا مهما في العملية المرضية لإزالة الميالين الالتهابية. لفهم خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية مثل التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصب البصري ، نقترح بروتوكول فرز الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية حول الآفات. يستخدم هذا البروتوكول فرز الخلايا العمودية المنشطة مغناطيسيا (MACS) للحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية النقاء والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة للتحقيق في الآثار المحتملة للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية.

الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام حبات CD11b ذات نقاء عال تم عزل الخلايا الدبقية الدقيقة حول الآفات في نماذج فئران إزالة الميالين باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه واختبارها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يتم تصنيف الخلايا بشكل فلوري باستخدام CD11b-fluorescein isothiocyanate (FITC) و CD45-allophy...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

يساعد هذا البروتوكول على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن آفات إزالة الميالين المجهرية في دماغ الفأر البالغ لدراسة الخصائص الدبقية الدقيقة في الجسم الحي. توفر هذه التقنية الوقت ولها متطلبات أقل لكل من المجربين والمعدات. تساعد هذه الطريقة على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الحيوان ، وخاصة تلك الأنسجة المجهرية في حالات مرضية مختلفة.ابدأ بالتشريح المجهري للآفات الموسومة بصبغة محايدة حول الجسم الثفني تحت المجهر المجسم. الطرد المركزي للأنسجة المشرطة في 300 مرة غرام لمدة 30 ثانية لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب. مزيج إنزيم التسخين المسبق واحد ومزيج الإنزيم من اثنين إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.ثم ، أضف 1،950 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، وامزج عينة واحدة إلى عينة واحدة ، وهضمها في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 30 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، واخلطه بلطف. بعد الهضم ، أضف أربعة ملليلترات من PBS البارد إلى الأنبوب ، ورجه بلطف.الطرد المركزي لعينات الأنسجة في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant ببطء وبشكل كامل. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف باستخدام 1،550 ميكرولتر من PBS الباردة. أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام ، واخلطها جيدا.استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتراكب الخليط ببطء شديد ، وبلطف مع ملليلتر من PBS الباردة. الطرد المركزي للخليط ، ثم ابحث عن الطبقات الثلاث. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لشفط الطبقتين العلويتين بالكامل ، واملأ الأنبوب حتى خمسة ملليلترات بمخزن مؤقت للتحميل البارد.قلب الأنبوب بلطف ثلاث مرات. بعد ذلك ، بعد الطرد المركزي وشفط supernatant ، أعد تعليق بيليه الخلية مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل ، وأضف 10 ميكرولترات من حبات CD11b. تخلط جيدا ، وتحضن لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت ، واغسل الخلايا عن طريق سحب السائل بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant تماما لإزالة الخرز غير المقيد. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، وضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.شطف العمود مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي على أساس بروتوكول الشركة المصنعة. قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS ، وتخلص من التدفق الذي يحتوي على الخلايا غير المسماة. أضف 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت لغسل العمود وإزالته من الفاصل.ضع العمود على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، وأضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت إلى العمود. أخيرا ، ادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من آفات إزالة الميالين للفئران البالغة قبل وبعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.تمثل الصور الرسومية ارتفاع التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا ومنطقة التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الأمامي لاختيار الخلايا المفردة وCD11b-FITC وCD45-APC لاختيار الخلايا النخاعية والخلايا الدبقية الصغيرة. زادت نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل كبير بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. تمثل الصورة الرسومية استراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا المفردة الحية والميتة بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.هنا ، تم استخدام 7-aminoactinomycin D وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا الحية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تشريح الآفات المزيلة للميالين بدقة تحت المجهر المجسم بناء على العلامات الحمراء المحايدة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

نماذج من الماوس تلين بيضاء المحيطة بالبطين

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

فحوصات حاسة الشم لنماذج من الماوس مرض الاعصاب

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

التجريبية إزالة الميالين وعودة الميالين من الحبل الشوكي الفئران عن طريق حقن البؤري من ليزوليسيتين

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

تحليل يستند إلى الخلية لدراسة التخليص تاو جسم بوساطة من Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...