Name: isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination at JoVE.com

이 연구는 Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06)의 지원을 받았다.

모든 동물 절차는 Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다.
1. 재료
<ol><li>프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결 방법을 준비하십시오.<ol>
<li>인산완충식염수(PBS)에 우태아혈청(FBS, 2%)을 첨가하여 로딩버퍼를 준비한다.</li>
		<li>PBS에 중성 적색 (NR) 염료 (최종 1 %)를 첨가한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시판?...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain.">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li><li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development.">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li><li>Cunningham, C. L., Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex.">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration.">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+microglial+subset+in+development,+aging,+and+disease:+Lessons+from+transcriptomic+studies.">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).</li><li>Y&#305;ld&#305;zhan, K., Naz&#305;ro&#287;lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases.">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li><li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/brain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology.">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li><li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+the+brain:+Complementary+partners+in+development+and+disease.">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li><li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+during+human+brain+development.">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).</li><li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2010).</li><li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP(+)-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia.">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microglia.">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye.">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li><li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination.">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).</li><li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+&amp;+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans.">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing &amp; enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system.">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells.">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).</li></ol>

이 프로토콜은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포를 분리하는 방법을 제안한다. CD11b 비드를 사용하여 포획된 미세아교세포는 높은 순도 및 생존력을 나타낸다. 프로토콜의 중요한 단계에는 초점의 정확한 국소화와 최적의 미세아교세포 정제가 포함됩니다. 프로토콜 단계 2.1에서, 병변이 정확하게 표시될...

Microglia는 노른자 - 낭 선조에서 유래하며, 배아 뇌에 매우 일찍 도달하여 CNS 1,2의 발달에 참여합니다. 예를 들어, 그들은 시냅스 가지치기3 및 축삭 성장 조절4에 관여한다. 그들은 신경 생존을 촉진하고 신경 국소화를 돕는 인자를 분비합니다5. 동시에, 그들은 정상적인 뇌 발달을 보장하기 위해 비정상적인 세포와 사멸 세포를 제거하는 데 관여합니다6. 또한, 뇌의 면역능력이 있는 세포로서, 미세아교세포는 뇌 실질종을 지속적으로 감시하여 죽은 세포, 기능장애성 시냅스, 세포 파편7을 제거한다. 미세아교세포 활성화가 염증성 탈수초성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 뇌종양을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. 다발성 경화증 (MS)에서 활성화된 미세아교세포는 올리고덴드로사이트 전구체 세포 (OPCs)의 분화 및 미엘린 파편을 삼킴으로써 미엘린의 재생에 기여한다8.
알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 축적은 미세 아교세포를 활성화시켜 미세 아교세포9의 식세포 및 염증 기능에 영향을 미칩니다. 신경교종 관련 미세아교세포(GAM)라고 불리는 신경교종 조직에서 활성화된 미세아교세포는 신경교종의 진행을 조절할 수 있으며 궁극적으로 환자(10)의 예후에 영향을 미칠 수 있다. 활성화는 미세아교세포 전사체를 심오하게 변화시켜 형태학적 변화, 면역 수용체의 발현, 식세포 활성 증가, 사이토카인 분비 강화(11)를 초래한다. 신경 퇴행성 질환에서 활성화된 미세아교세포의 상이한 서브세트, 예컨대 질환 관련 미세아교세포 (DAM), 활성화된 반응 미세아교세포 (ARM), 및 미세아교세포 신경퇴행성 표현형(MGnD)8이 있다.
유사하게, 미세아교세포의 다수의 동적 기능적 서브세트는 또한 염증성 탈수초성 질환(12)에서 뇌에 공존한다. 미세아교세포의 상이한 서브세트 사이의 이질성을 이해하는 것은 염증성 탈수초성 질환의 발병기전을 조사하고 그들의 잠재적인 치료 전략을 찾는 데 필수적이다. 미세아교세포의 이질성은 주로 분자 특이성8에 의존한다. 이질성의 연구를 위해 미세 아교세포의 분자 변화를 정확하게 설명하는 것이 필수적입니다. 단일 세포 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 기술의 발전은 병리학 적 조건13에서 활성화 된 미세 아교세포의 분자 특성의 확인을 가능하게했습니다. 따라서, 세포 집단을 단리하는 능력은 특정 조건 하에서 이들 표적 세포의 추가 조사를 위해 중요하다.
microglia의 특성과 기능을 이해하기 위해 수행 된 연구는 일반적으로 시험관 내 연구이며, 많은 수의 1 차 미세 아교세포가 배양 플라스크에 부착되고 다른 혼합 신경교 세포와 함께 플라스틱 표면에서 자라는 마우스 강아지 두뇌 (1-3 일 이전)에서 제조되고 배양 될 수 있음이 밝혀 졌기 때문입니다. 이어서, 순수한 미세아교세포는 혼합된 신경교세포(14,15)의 상이한 접착성에 기초하여 단리될 수 있다. 그러나이 방법은 주산기 뇌에서 미세 아교세포를 분리 할 수 있으며 몇 주가 걸립니다. 세포 배양에서 잠재적인 변수는 분자 발현16과 같은 미세아교세포 특성에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 이러한 방법에 의해 단리된 미세아교세포는 CNS 질환의 상태를 시뮬레이션함으로써 시험관내 실험에만 참여할 수 있으며, 생체내 질환 상태에서 미세아교세포의 특성과 기능을 나타낼 수 없다. 따라서 성인 마우스 뇌에서 미세 아교세포를 분리하는 방법을 개발할 필요가 있습니다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 자기 분리는 널리 사용되는 두 가지 방법이지만 고유 한 제한 사항16,17,18,19이 있습니다. 각각의 장점과 단점은 토론 섹션에서 대조 될 것입니다. MACS 기술의 성숙은 세포를 신속하게 정화 할 수있는 가능성을 제공합니다. Huang et al.은 뇌의 탈수초성 병변을 라벨링하는 편리한 방법을 개발했습니다20. 이 두 가지 기술적 접근 방식을 결합하여 우리는 신속하고 효율적인 원주형 CD11b 자기 분리 프로토콜을 제안하여 성인 마우스 뇌에서 탈수초성 병변 주위의 미세 아교세포를 분리하고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하기위한 단계별 설명을 제공합니다. 국소 탈수초성 병변은 프로토콜 21을 시작하기 3일 전에 코퍼스 캘로섬에 2 μL의 리솔레시틴 용액 (0.9% NaCl 중1% LPC)의 입체주성 주사에 의해 야기되었다. 이 프로토콜은 시험관내 실험에서 다음 단계를 수행하기 위한 토대를 마련합니다. 또한이 프로토콜은 시간을 절약하고 다양한 실험에서 널리 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>SJA Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) Beads, human and mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1013690025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte Flow Cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>A system consisting of various parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>BOSTER</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>MshOt</td>
			<td>MZ62</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse primary microglia by magnetic-activated cell sorting in animal models of demyelination

뇌에 상주하는 선천적 면역 세포 인 Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 염증 또는 손상에 대한 주요 반응자입니다. 미세아교세포는 휴지 상태와 활성화 상태로 나눌 수 있으며 뇌의 미세 환경에 반응하여 상태를 빠르게 변화시킬 수 있습니다. Microglia는 다른 병리학 적 조건 하에서 활성화되고 다른 표현형을 나타낼 것입니다. 또한, 활성화된 미세아교세포의 많은 상이한 하위군이 존재하며, 상이한 하위군 사이에 큰 이질성이 있다. 이질성은 주로 미세아교세포의 분자 특이성에 의존한다. 연구에 따르면 microglia가 활성화되고 염증성 탈수초화의 병리학 적 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 나타났습니다. 다발성 경화증 및 신경 척수염 옵티카 스펙트럼 장애와 같은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 특성을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 perilesional 원발성 미세아교세포 분류 프로토콜을 제안한다. 이 프로토콜은 원주형 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 고도로 정제 된 일차 미세 아교세포를 얻고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하여 염증성 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 잠재적 영향을 조사합니다.

CD11b 비드를 사용하여 분리된 미세아교세포는 고순도를 갖는다. 탈수초화 마우스 모델에서 병변 주위의 미세아교세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 단리하고 유세포 분석기에 의해 시험하였다. 세포는 CD11b-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 CD45-알로피코시아닌 (APC)으로 형광 표지되어 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기에서 미세아교세포를 결정한다. CD11b 및 CD45 ...

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Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

이 프로토콜은 생체 내에서 미세아교세포 특성을 연구하기 위해 성인 마우스 뇌의 미세해부된 탈수초화 병변으로부터 미세아교세포를 분리하는 것을 돕는다. 이 기술은 시간을 절약하고 실험자와 장비 모두에 대한 요구 사항이 낮습니다. 이 방법은 미세 아교세포를 동물의 뇌, 특히 다양한 질병 상태의 미세 해부 된 조직에서 분리하는 데 도움이됩니다.먼저 코퍼스 캘로섬 주위의 중성 염료로 표지된 병변을 입체현미경으로 미세해부한다. 해부된 조직을 30초 동안 300회 g에서 원심분리하여 튜브의 바닥에서 샘플을 수집한다. 예열 효소 하나를 혼합하고 효소는 인큐베이터에서 섭씨 37도까지 두 개를 섞습니다.그런 다음 1, 950 마이크로 리터의 예열 된 효소를 첨가하여 1 ~ 1 개의 샘플을 혼합하고 섭씨 37 도의 인큐베이터에서 5 분 동안 소화하십시오. 30 마이크로 리터의 예열 된 효소 믹스 두 개를 넣고 부드럽게 섞으십시오. 소화 후, 튜브에 차가운 PBS 네 밀리리터를 넣고 부드럽게 흔들어주십시오.조직 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 g로 원심분리하고, 상층액을 천천히 그리고 완전히 흡인한다. 세포 펠릿을 1, 550 마이크로리터의 차가운 PBS로 부드럽게 재현탁시킨다. 파편 제거를 위해 차가운 용액 450 마이크로 리터를 넣고 잘 섞으십시오.1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 혼합물을 매우 천천히 그리고 두 밀리리터의 차가운 PBS로 부드럽게 오버레이하십시오. 혼합물을 원심분리하고, 이어서 세 층을 찾는다. 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 두 개의 최상층을 완전히 흡인하고 냉간 로딩 버퍼로 튜브를 최대 다섯 밀리리터까지 채 웁니다.튜브를 세 번 부드럽게 뒤집습니다. 다음에, 원심분리 및 상청액의 흡인 후, 세포 펠릿을 90 마이크로리터의 로딩 완충액으로 재현탁시키고, 10 마이크로리터의 CD11b 비드를 첨가한다. 잘 섞어서 섭씨 네 도에서 15 분 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 로딩 버퍼 1밀리리터를 첨가하고, 1, 000-마이크로리터 피펫으로 액체를 위아래로 부드럽게 피펫팅함으로써 세포를 세척한다. 세포를 섭씨 네 도에서 10분 동안 300배 g에서 원심분리하고, 상층액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거하였다. 세포를 로딩 버퍼의 500 마이크로리터에 재현탁시키고, 자기장에 양성 선택을 위해 그의 분리기와 함께 MS 컬럼을 배치한다.500 마이크로 리터의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구어 세포를 보호하고 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 분류의 효율성을 보장하십시오. 세포 현탁액을 MS 컬럼 상에 적용하고, 표지되지 않은 세포를 함유하는 유동 관통을 폐기한다. 로딩 버퍼 500 마이크로리터를 첨가하여 컬럼을 세척하고, 분리기에서 제거한다.컬럼을 15밀리리터 원심분리 튜브에 놓고 로딩 버퍼 1밀리리터를 컬럼에 추가합니다. 마지막으로, 플런저를 컬럼의 바닥으로 밀어 자기 표지 된 세포를 플러시하십시오. 자기-활성화 세포 분류 전후의 성인 마우스의 탈수초화 병변으로부터 단리된 미세아교세포의 유세포 분석에 사용된 게이팅 전략의 개략적인 표현이 여기에 제시되어 있다.그래픽 이미지는 세포를 선택하기 위한 전방 산란 높이 및 측면 산란 높이, 단일 세포를 선택하기 위한 전방 산란 영역 및 전방 산란 높이, 골수성 세포 및 미세아교세포를 선택하기 위한 CD11b-FITC 및 CD45-APC를 나타낸다. 미세아교세포의 비율은 자기-활성화된 세포 분류 후에 유의하게 증가하였다. 그래픽 이미지는 자기-활성화 세포 분류 후 살아있는 단일 및 죽은 단일 세포에 대한 유세포 분석 분석에 사용된 게이팅 전략을 나타낸다.여기서, 7-아미노악티노마이신 D 및 측면 산란 높이가 살아있는 세포를 선택하는데 사용되었다. 이 절차를 시도하는 동안 중성 적색 표시를 기반으로 입체 현미경으로 탈수초성 병변을 정확하게 미세 해부하는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

연구

신경과학

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에 대한 후각 분석 실험

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...