Denna teknik möjliggör identifiering av cellerna med olika invasiva kapaciteter under påverkan av utsöndrade faktorer från samodlingade stromaceller. Tekniken bedömer effekten av utsöndrade faktorer från samodlingade stromala- eller immunceller på cellinvasion. Det möjliggör också återhämtning och analys av invasiva cellsubpopulationer som finns i heterogena cellblandningar.
Tekniken kan avgöra vilka tumörer som har invasiva cellsubpopulationer som leder till metastasering. Fångst och analys av invasiva cancerceller kan informera behandlingsbeslut. För att börja cellodlingen, tvätta vidhäftningscellkulturerna med cirka 70% sammanflöde med 1X fosfatbuffrad saltlösning.
Tillsätt sedan 0,05% trypsin och EDTA-lösning för att lyfta av cellerna. Neutralisera trypsinlösningen med cellodlingsmedier innehållande serum och räkna cellerna med hjälp av en alikvot av cellsuspensionen. Placera alla tre sterila kamrarna i vävnadsodlingshuven.
Leta reda på ratten på kortsidan av den nedre kammaren och orientera den nedre kammaren så att ratten är vänd mot experimenteraren. Tillsätt 30 000 till 50 000 celler i 90 mikroliter media till varje brunn från den nedre kammaren utan att bilda några bubblor. Använd 5% av fostrets bovina serum kompletterade media i två nedre kamrar som en positiv kontroll för cellmotilitet, och använd 0% serum kompletterat media som en negativ kontroll.
Vrid den nedre kammaren vid 90 grader efter att ha låtit den sätta sig i 10 till 15 minuter i huven. Placera sedan mittkammaren ovanpå så att ratten på den nedre kammaren glider in i skåran på mittkammaren. Tryck kammaren vertikalt nedåt tills ett klick hörs från var och en av enhetens långsidor.
Tillsätt 160 mikroliter serumfritt medium till alla brunnar i mittkammaren. Se till att en kupolformad menisk är synlig efter att brunnarna är fyllda och placera den övre kammaren med elektroder vända ner på mittkammaren för att rikta in de blå prickarna på mitten och övre kamrarna. Tryck kammaren vertikalt nedåt tills ett klickljud hörs från var och en av enhetens långsidor.
Tillsätt 20 till 50 mikroliter serumfritt medium till den övre kammaren. Montera enheten på cellanalysatorn med dubbla syften i vävnadsodlingsinkubatorn och vänta 30 minuter innan du mäter bakgrunden. Öppna cellanalysatorprogramvaran, välj sedan vaggan som ska användas, följt av ett klick på meddelandefliken och se till att det står Anslutningar okej "för att säkerställa att matrisen är väl placerad i vaggan och elektroderna är väl anpassade till sensorerna.
Klicka på fliken experimentanteckningar och fyll i all möjlig information om experimentet. Klicka sedan på layoutfliken och fyll i beskrivningen av arraylayouten. Klicka sedan på fliken Schema och lägg till två steg från stegmenyn, ett bakgrundssteg med ett svep och ett teststeg med 100 svep.
När matrisen har varit i inkubatorn för cellanalysatorer med dubbla syften i 30 minuter klickar du på uppspelningsknappen för att starta bakgrundsmätningen. När bakgrundsmätningen är klar, ta bort matrisen från vaggan och placera den tillbaka i cellodlingshuven. Tillsätt sedan 30 000 till 50 000 celler i 100 mikroliter serumfritt media till varje brunn i toppkammaren.
Dessa är de celler som elektroden kommer att upptäcka när de framgångsrikt migrerar genom membranet. Låt aggregatet stå i huven i 30 minuter innan du monterar på den dubbla cellanalysatorn för impedansmätning. Placera matrisen tillbaka i cellanalysatorn med dubbla syften och kontrollera meddelandefliken för meddelandet Anslutningar okej".
Klicka på uppspelningsknappen för att starta impedansmätningen och klicka sedan på fliken Plot för att övervaka signalens framsteg. Om slutpunkten nås före 25 timmar klickar du på avbryt-steget i listrutan Kör. Om du vill exportera data högerklickar du på diagrammet, väljer kopiera i listformat och klistrar sedan in data i ett kalkylblad.
Övervaka migreringshastigheten i realtid på cellanalysatorn med dubbla syften för att bestämma stopppunkten för intresse. När det har uppnåtts, demontera enheten från den dubbla cellanalysatorn och placera den i vävnadsodlingshuven. Förbered ett lämpligt antal 1,5 ml mikrocentrifugrör för att samla cellerna från brunnarna av intresse.
Placera enheten i en 10 centimeter skål för att innehålla vätskor när kamrarna lossnar. Tryck de flexibla knäppningsändarna på långsidan av mittkammaren inåt tills ett klickljud hörs, följt av att demontera den övre kammaren och invertera den till en ny 10 centimeter skål. Använd en celllyftare med ett 13 millimeter blad för att samla cellerna från alla brunnar som har samma experimentella tillstånd.
Skölj eller doppa bladet i 1X fosfatbuffrad saltlösning för att samla cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Snurra sedan ner cellerna vid 500 gånger G i fem minuter och föröka dessa insamlade celler eller utför slutpunktsanalys såsom encellig RNA-sekvensering. Bedömning av invasion av cellerna i närvaro eller frånvaro av stromaceller visade att MDA-MB-231-cellinvasion förbättrades när bestrålade swiss-3T3 fibroblaster J2-stam satt i bottenkammaren för utbyte av faktorer mellan de två cellinjerna.
Intressant nog ökade MDA-MB-231 invasionen när 3T3 J2-celler fördubblades i antal. Å andra sidan verkar invasionshastigheten för en invasiv klon av MCFDCIS-celler, DCIS-Delta Four, hämmas av överhörningen med 3T3 J2-celler, vilket tyder på den värdefulla tillämpningen av trekammarmatrisen för att mäta varierande effekter av stroma. I detta fall fibroblaster på cellinvasion.
Humana navelvenendotelceller var mer invasiva som svar på faktorer som utsöndrades av MDA-MB-231-celler, till skillnad från de som utsöndras av DCIS-celler, vilket överensstämmer med invasiva tumörers förmåga att rekrytera endotelceller för blodkärlsbildning och senare spridning i cirkulationen. Patient-härledda xenograftceller invasion från den övre kammaren ökade som svar på samodlade humana benmärgs immunceller. Intressant nog var närvaron av 2% serum i bottenkammaren med de humana benmärgs immuncellerna avgörande för patienthärledd xenotransplantatinvasion.
Brunnar kan beläggas med en extracellulär matris för att efterlikna basalmembranbarriären. Terapeutiska medel kan tillsättas till media i brunnarna för att övervaka deras effekt på invasionen.