Name: electrophysiological methods for measuring photopigment levels in drosophila photoreceptors
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF) et de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël (BSF). Nous remercions M. Anatoly Shapochnikov pour la construction du réchauffeur de filament de cire.

1. Mesure de la relation intensité-réponse, de l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et du potentiel récepteur précoce (ERP) à l’aide de l’électrorétinogramme
<ol><li>Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de D. melanogaster<ol>
<li>Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant de la nourriture dans un incubateur maintenu à une température de 24 ° C et dans un cycle sombre / clair de 12...

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	<li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment.">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li><li>Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+invertebrate+photoreceptors:+role+of+pigment+bistability.">Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability.</a> Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).</li><li>Hamdorf, K., Autrum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Sensory Physiology. 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Le principal avantage de l’utilisation de la préparation de photorécepteurs de drosophile est son accessibilité, la facilité et la précision de la stimulation lumineuse et, surtout, la capacité d’appliquer la puissance de la génétique moléculaire7. Des études génétiques approfondies ont établi la drosophile comme un système modèle extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes7. La structure relative...

La rhodopsine (R) activée par la lumière, qui est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG), est composée d’une protéine transmembranaire 7 (opsine) et d’un chromophore. Chez Drosophila melanogaster (mouche des fruits), l’absorption des photons induit l’isomérisation du chromophore rétinien 11-cis-3-OH en tout-trans-3-OH-rétinien1, favorisant le changement conformationnel de la rhodopsine en métarhodopsine (M, Figure 1A). Contrairement à la rhodopsine vertébrée, la fraction prédominante du chromophore invertébré ne se dissocie pas de l’opsine, ce qui entraîne l’état pigmentaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité M. À son tour, l’absorption supplémentaire de photons par le chromophore rétinien entièrement trans-3-OH induit l’isomérisation du chromophore 2,3, générant l’état pigmentaire R avec le chromophore rétinien 11-cis-3-OH. L’état R est un photopigment sombre, stable et physiologiquement non actif. En plus de la voie de régénération des photons extrêmement rapide du chromophore4, un peu comme les photopigments des vertébrés, il existe une voie lente enzymatique alternative pour la régénération des chromophores chez les invertébrés, dans laquelle certaines des étapes sont effectuées dans les cellules rétiniennes entourant les cellules photoréceptrices 5,6.
La drosophile présente de grands avantages en tant qu’organisme modèle pour l’étude des photorécepteurs d’invertébrés. En particulier, l’accessibilité de la préparation et la capacité d’appliquer la génétique moléculaire ont fait de la drosophile un puissant système modèle7. Par conséquent, plusieurs méthodes expérimentales in vivo et ex vivo pour étudier la phototransduction en général et les niveaux de photopigment, en particulier, ont été établies. La méthode in vivo la plus simple exploite la réponse de tension extracellulaire relativement grande enregistrée à la lumière de l’œil de la drosophile. En conséquence, la stimulation lumineuse évoque une réponse de tension électrique dans l’ensemble de l’œil qui peut être mesurée à l’aide de l’enregistrement extracellulaire par électrorétinogramme (ERG), qui est ~ 3 ordres de grandeur plus grand que la réponse ERG à la lumière des yeux vertébrés 8,9. La réponse ERG de la drosophile est robuste et facile à obtenir, ce qui en fait une méthode pratique pour identifier les anomalies de la réponse à la lumière dues aux mutations. La réponse ERG à la lumière provient principalement des photorécepteurs, des cellules pigmentaires (glie) et des neurones secondaires de la lame (voir la figure 1B). Les principaux composants de l’ERG sont (i) la réponse en tension extracellulaire des photorécepteurs, (ii) les transitoires « on » et « off » au début et à la fin du stimulus lumineux qui proviennent des neurones de la lame (Figure 2A, inset, ON, OFF), (iii) la réponse lente des cellules gliales (Figure 2A, encart, flèches), et (iv) la réponse brève et transitoire, résultant d’un déplacement de charge lors de l’activation du photopigment qui précède le transitoire ON10 (Figure 2C [encart], D, E). Cette réponse brève est composée de deux phases (M1 et M2, Figure 2C [encadré]) et ne peut être induite que par une stimulation lumineuse extrêmement forte, qui active simultanément des millions de molécules de photopigment. Il n’est observé ni sous stimulation bleue (Figure 2D, trace bleue) ni chez les mutants ayant des niveaux de photopigment fortement réduits (Figure 2E, trace rouge), mais son amplitude est légèrement augmentée chez un mutant qui abolit l’activité PLC (Figure 2E, trace orange). La phase M1 est un ERP typique de la mouche résultant de l’activation de M dans les photorécepteurs. La phase M1, qui a une polarité positive (intracellulaire), libère un neurotransmetteur de manière normale dans une synapse inversant les signes et active les neurones de la lame, qui répondent à la dépolarisation des photorécepteurs en générant la phase M2 amplifiée synaptiquement. Ainsi, les phases M1 et M2 reflètent l’activation M10,11.
La dépolarisation du photorécepteur génère le transitoire « on » cornéen positif, résultant de la synapse d’inversion des signes entre l’axone photorécepteur et les neurones monopolaires de la lame 10,11 (Figure 1B). La lente montée et la désintégration de l’ERG résultent de la dépolarisation des cellules pigmentaires (Figure 2A, encart, flèches) principalement due à l’efflux K+ des cellules photoréceptrices12 via les canaux 13,14,15 du potentiel récepteur transitoire (TRP) et TRP-like (TRPL). Ces composants cinétiques lents masquent et déforment en grande partie la forme d’onde de la réponse photoréceptrice par rapport aux enregistrements intracellulaires ou à cellules entières de la réponse photoréceptrice à la lumière 9,10. De plus, à des éclairements très forts, une réponse transitoire supplémentaire, qui précède et fusionne partiellement avec le transitoire « on », peut être observée (Figure 2C [encart], D,E). Ce signal provient directement de l’activation massive du photopigment10.
Plusieurs protocoles de régime lumineux utilisant des filtres de densité neutre (ND) et de couleur, ainsi que de forts éclairements, ont été développés pour étudier l’œil en général et la cascade de phototransduction en particulier. Ces protocoles ont également été utilisés pour étudier les propriétés du photopigment.
Le protocole intensité-réponse mesure l’amplitude de crête de la réponse en tension ERG de l’ensemble de l’œil à l’augmentation des intensités lumineuses (Figure 2A, B). Ce protocole aide à détecter les changements dans la sensibilité des cellules photoréceptrices à la lumière9.
Le protocole postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite les différences dans les spectres d’absorption de la rhodopsine et de la métarhodopsine qui permet, chez la drosophile, une conversion massive du photopigment de R à son état M intermédiaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité2. Dans la réponse de tension ERG, une impulsion relativement courte de lumière saturante est donnée et la réponse de tension résultante est enregistrée. Dans cette condition, un plafond (potentiel d’inversion) est atteint par le signal de dépolarisation car l’activation d’une fraction de pourcentage de l’énorme quantité de molécules de rhodopsine (~1 x 108) est suffisante pour atteindre le plafond. La présence des composants de phototransduction en grande abondance garantit que ce plafond sera atteint même chez les mutants avec une réduction significative de la concentration ou un dysfonctionnement subtil des composants de phototransduction. Cette situation empêche l’isolement de ces mutants. Pak et al. ont introduit le dépistage PDA7 à la recherche d’un test fiable et révélateur pour isoler les mutants visuels. Chez la drosophile, la réponse PDA est provoquée par l’élimination génétique du pigment de criblage rouge, ce qui permet la conversion du photopigment, et l’application de lumière bleue, qui est préférentiellement absorbée par la rhodopsine (Figure 3A) et, par conséquent, entraîne une conversion nette importante de l’état de photopigment R à M. La terminaison de la phototransduction est perturbée au niveau du photopigment par une conversion nette importante de R en M, ce qui, à son tour, entraîne une excitation soutenue longtemps après l’extinction de la lumière (Figure 2C, Figure 4A [en haut]). Pendant la période PDA, les photorécepteurs sont moins sensibles aux lumières d’essai ultérieures et sont partiellement désensibilisés (inactivés). Le PDA détecte même les défauts mineurs dans la biogenèse de la rhodopsine et teste la capacité maximale de la cellule photoréceptrice à maintenir l’excitation pendant une période prolongée. Comme il dépend strictement de la présence de fortes concentrations de rhodopsine, il obtient facilement des scores pour un réapprovisionnement déficient des composants de phototransduction. Remarquablement, l’écran PDA a donné de nombreux mutants visuels nouveaux et très importants (examinés dans Pak et al.7). Ainsi, les mutants PDA isolés par Pak et al.7 sont encore extrêmement utiles pour analyser le système visuel de la drosophile .
La PDA est induite chez la drosophile par la saturation de la lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation continue longtemps après le décalage de la lumière (Figure 4A [en haut]). Après avoir saturé la lumière bleue induisant le PDA, les photorécepteurs périphériques (R1-6) restent continuellement actifs dans l’obscurité à leur capacité maximale, atteignant la saturation. Des lumières bleues saturantes supplémentaires pendant le PDA ne produisent aucune réponse supplémentaire dans les cellules R1-6 pendant de nombreuses secondes, mais induisent une réponse dans les cellules R7-8 qui se superpose au PDA. Les réponses superposées s’expliquent par les différents spectres d’absorption des photopigments exprimés dans ces cellules (R7-8)16. Le PDA peut être supprimé par la photoconversion de M en R avec une lumière orange saturée (Figure 4A [en haut]). La capacité du PDA à amener les cellules photoréceptrices à leur capacité active maximale, une situation qui ne peut être atteinte par une lumière blanche intense, explique pourquoi il a été un outil majeur pour dépister les mutants visuels de la drosophile. En effet, il permet de détecter même des défauts mineurs dans les protéines impliquées dans la biogenèse des niveaux normaux de photopigment17,18. Deux groupes de mutants défectueux PDA ont été isolés : ni les mutants inactivation ni les mutants après-potentiel (nina) et les mutants inactivés mais pas les mutants après-potentiels (ina). Le phénotype du premier est l’absence de PDA et l’inactivation associée résultant d’une réduction importante des niveaux de photopigment (Figure 4A [milieu]). Le phénotype de ce dernier montre une inactivation mais pas de dépolarisation sombre après lumière bleue en raison d’un mécanisme encore inconnu chez le mutant avec des niveaux normaux de rhodopsine mais dépourvu de protéines interagissant avec les canaux TRP (Figure 4A [en bas]).
Le PDA résulte de la différence dans la quantité de photopigment par rapport à l’arrestine (ARR2), qui lie et met fin à l’activité M 19,20,21 (Figure 1A). Chez les photorécepteurs de la drosophile, la quantité de photopigment est environ cinq fois plus grande que la quantité d’ARR219. Ainsi, les niveaux d’ARR2 sont insuffisants pour inactiver toutes les molécules M générées par une grande photoconversion nette de R à M, laissant un excès de M constamment actif dans l’obscurité 17,19,20,22,23. Ce mécanisme explique l’élimination de la réponse PDA par mutations ou par privation de caroténoïdes24,25, provoquant une réduction du niveau de photopigment, mais n’affecte pas les niveaux d’arrestine. De plus, cette explication tient également compte des phénotypes de l’allèle21 mutant ARR2 nul (arr23), dans lequel la PDA pourrait être obtenue à des intensités de lumière bleue plus faibles d’environ10 fois 19,20,21 (Figure 4B,C). Le PDA n’est pas une caractéristique unique des photorécepteurs de mouches, et il apparaît chez toutes les espèces testées qui ont un M stable sombre avec un spectre d’absorption différent de celui de l’état R, permettant une photoconversion suffisante du photopigment de l’état R à l’état M. Une espèce soigneusement étudiée chez laquelle la phénoménologie PDA a été découverte est le photorécepteur barnacle (Balanus), dans lequel le spectre d’absorption de l’état R est dans une longueur d’onde plus longue que l’état M2 (Figure 3B). En conséquence, contrairement à la situation dans la mouche, dans la bernacle, la lumière orange-rouge induit un PDA, tandis que la lumière bleue supprime le PDA2.
Le protocole ERP (Early Receptor Potential) exploite le déplacement de charge qui se produit lors de l’activation de R ou M. Le pigment visuel fait partie intégrante de la membrane superficielle du compartiment de signalisation des membranes des vertébrés et des invertébrés3. En conséquence, le processus d’activation dans lequel les molécules de photopigment passent d’un état intermédiaire à l’autre s’accompagne d’un déplacement de charge 4,26. Comme les molécules de photopigment sont alignées électriquement en parallèle avec la capacité membranaire4, un changement conformationnel synchronisé rapide génère un changement de polarisation rapide de la membrane de surface, qui, chez les mouches, se produit dans le compartiment de signalisation composé d’une pile d’environ 30 000 à 50 000 microvillosités appelée rhabdomere. Cette polarisation se décharge ensuite passivement à travers la capacité membranaire du corps cellulaire jusqu’à ce que la membrane cellulaire soit également polarisée. L’ERP est l’enregistrement extracellulaire du déplacement de charge. L’ERP intracellulaire enregistré manifeste l’ERP extracellulaire intégré par la constante de temps de la membrane cellulaire 4,27,28. Le courant activé par le déplacement de la charge pigmentaire visuelle a également pu être mesuré dans les enregistrements de tension-pince de cellule entière29,30 (Figure 5A-D), avec l’avantage majeur (dans les enregistrements de courant récepteur précoce (ERC)) de minimiser l’effet de la capacité membranaire sur la cinétique du signal.
La section du protocole décrit comment effectuer des mesures ERG à partir de mesures de l’œil de drosophile 9 et des mesures ERC par des enregistrements de cellules entières d’ommatidies isolées de drosophiles 31,32. Nous décrivons également des protocoles spécifiques qui sont utilisés pour étudier la phototransduction en général et les photopigments en particulier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Figure 6M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td>Dumont #5, Standard</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 condenser lenses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Digidata 1200</td>
			<td>Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Almost perfect electronics</td>
			<td></td>
			<td>Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VW-3036-OPT-01</td>
			<td>Figure 7H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL1500 LCD</td>
			<td>Figure 6C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Kimwipes (Figure 6K)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>OG590, Edge filter</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BP450/40 nm</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color)</td>
			<td>Blazers</td>
			<td>550 nm</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Color) for cold light source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>RG630</td>
			<td>Figure 6C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (Heat)</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KG3</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (Neutral density filter)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td>Figure 7S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash Lamp system</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td></td>
			<td>Figure 7U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly sleeper system with injector</td>
			<td>Inject + matic</td>
			<td></td>
			<td>Figure 6A-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp power supply</td>
			<td>PTI</td>
			<td>LPS-220</td>
			<td>Figure 7W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light detector</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Phototransistor (Figure 7O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature melting wax</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Composed of mixture of beeswax (Tm&#8776;62 &#176;C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55&#8211;56 &#176;C (Figure 6J)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand for flies</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Figure 6I and Figure 7Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode preamplifier system with head-stage</td>
			<td>Almost perfect electronics</td>
			<td></td>
			<td>Impedance tester (Figure 7G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator (mechanical coarse)</td>
			<td>Tritech Research, Narishige</td>
			<td>M-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator (mechanical fine)</td>
			<td>Leitz Microsystems</td>
			<td>Leitz Mechanical Micromanipulator</td>
			<td>Figure 7F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master 8</td>
			<td>Figure 7A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redux cream for electrocardiography</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Redux Electrolyte Cr&#232;me</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter driver</td>
			<td>Uniblitz, Vincent Associates</td>
			<td>VCM-D1 Single Channel Uni-stable</td>
			<td>Figure 7V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter system</td>
			<td>Uniblitz, Vincent Associates</td>
			<td>LS2 2 mm Uni-stable Shutters</td>
			<td>Figure 7V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Wire</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td>0.25&#8211;1 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron composed of a platinum-iridium filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 mm diameter (Figure 6F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic zoom Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2B</td>
			<td>Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic zoom Microscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td>Wild M5</td>
			<td>With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td>22 &#181;m PVDF filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter/ Narishige</td>
			<td>Model P-97/PP-830</td>
			<td>Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax filament heater</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>See figure S1 (Figure 6E-G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon Flash Lamp system</td>
			<td>Dr. Rapp OptoElectronic</td>
			<td>JML-C2</td>
			<td>Figure 7X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological methods for measuring photopigment levels in drosophila photoreceptors

La rhodopsine (R) couplée à la photopigment G-protéine de la drosophile est composée d’une protéine (opsine) et d’un chromophore. Le processus d’activation de la rhodopsine est initié par l’isomérisation du chromophore induisant l’absorption des photons, favorisant les changements conformationnels de l’opsine et entraînant un deuxième état photopigment stable et sombre (métarhodopsine, M). L’étude de ce photopigment bi-stable utilisant la mutagénèse aléatoire nécessite des méthodes simples et robustes pour le dépistage des mouches mutantes. Par conséquent, plusieurs méthodes de mesure des réductions des niveaux de photopigment fonctionnel ont été conçues. L’une de ces méthodes exploite les déplacements de charge dans le photopigment après l’absorption des photons et les énormes quantités de molécules de photopigment exprimées dans les photorécepteurs. Ce signal électrique, appelé potentiel récepteur précoce (ou courant récepteur précoce), est mesuré par diverses méthodes électrophysiologiques (par exemple, électrorétinogramme et enregistrements de cellules entières) et est linéairement proportionnel aux niveaux de photopigment fonctionnels. Les avantages de cette méthode sont le rapport signal/bruit élevé, la mesure linéaire directe des niveaux de photopigment et l’indépendance des mécanismes de phototransduction en aval de l’activation de la rhodopsine ou de la métarhodopsine. Une méthode électrophysiologique supplémentaire appelée postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite la bi-stabilité du photopigment de la drosophile et les différences spectrales d’absorption des états pigmentaires R et M des mouches. Le PDA est induit par une lumière bleue intense, convertissant des quantités saturées de rhodopsine en métarhodopsine, ce qui entraîne l’échec de la terminaison de la réponse lumineuse pendant une période prolongée dans l’obscurité, mais il peut être terminé par la conversion de la métarhodopsine en rhodopsine en utilisant une lumière orange intense. Étant donné que le PDA est un signal robuste qui nécessite une conversion massive du photopigment, même de petits défauts dans la biogenèse du photopigment conduisent à un PDA anormal facilement détecté. En effet, des mutants PDA défectueux ont conduit à l’identification de nouvelles protéines de signalisation importantes pour la phototransduction.

La figure 2 illustre la robustesse et la facilité d’utilisation de la technique ERG. Il est robuste car il est enregistré dans la mouche pratiquement intacte par une technique simple d’enregistrements de tension extracellulaire qui nécessitent une configuration électrophysiologique simple. La robustesse se manifeste par l’obtention d’enregistrements de réponses lumineuses avec des amplitudes relativement grandes (de l’ordre du millivolt) même lorsque les mutations réduisent ...

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Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Ce protocole est particulièrement adapté au dépistage génétique des mutants drosophiles déficients visuels. En effet, ils permettent la détection de petites anomalies dans la phototransduction de la drosophile, en particulier dans les niveaux de photopigments et les fonctions liées aux pairs. Cette technique est profonde in vivo, facile à exécuter et très robuste, permettant la détection de petits changements dans l’activité des protéines de phototransduction.À mon avis, réparer les mouches tout en maintenant la viabilité est probablement la partie critique de cette méthode. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel Clampex. Allumez l’amplificateur et le générateur d’impulsions Master-8, puis allumez la lampe au xénon et le contrôleur de l’obturateur.Allumez l’extracteur et placez un capillaire en verre dans l’extracteur et tirez-le. Retirez le capillaire en verre de l’extracteur. Remplissez le capillaire en verre avec une solution de sonnerie filtrée à l’aide d’une seringue à embout allongé.Insérez l’électrode métallique dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution dans le capillaire est en contact avec le fil d’argent. Insérez les porte-électrodes dans les deux micromanipulateurs d’électrodes.Allumez l’alimentation du fer à souder. Réglez le courant sur environ 2,25 ampères. Ce courant devrait chauffer le filament platine-iridium de 0,25 millimètre à environ 55 à 56 degrés Celsius.Placez une goutte de cire à basse température de fusion sur le fer à souder. Anesthésiez les mouches dans le flacon. Versez les mouches anesthésiées dans le récipient dormeur, choisissez une mouche et couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.Tenez soigneusement la mouche par les ailes à l’aide d’une pince à épiler tranchante et placez-la sur le porte-mouche. Sur le porte-mouche, placez la mouche couchée sur le côté, le dos tourné vers la main. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez ses ailes au porte-mouche à l’aide du fer à souder.Connectez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire à l’aide du fer à souder. Abaissez la pointe du fer à souder jusqu’au point de jonction des jambes, puis faites fondre la cire pour couvrir toutes les jambes ensemble. Placez une petite goutte de cire entre la tête et le cou dans la région du cou.Placez le porte-mouche dans une cage de faraday sombre sur un bloc magnétique et assurez-vous que la mouche se trouve à environ cinq millimètres de l’extrémité du guide de lumière. Placez l’électrode d’enregistrement au-dessus de l’œil de la mouche et l’électrode de masse sur le haut du dos de la mouche à l’aide des micromanipulateurs. Insérez ensuite l’électrode de masse à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.Insérez l’électrode d’enregistrement dans la périphérie externe de l’œil de la mouche, de préférence à l’aide des micromanipulateurs. Fermez la cage de faraday et éteignez les lumières de la pièce pour permettre une adaptation à l’obscurité pendant cinq minutes. Entrez les paramètres à partir d’une durée d’impulsion de 500 mètres par seconde, d’un intervalle d’impulsion de 60 secondes et du nombre d’impulsions réglé sur six.Pour mesurer le PDA, réglez le générateur d’impulsions Master-8 en mode TRAIN, puis donnez une impulsion lumineuse de cinq secondes d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange. Vérifiez la réponse en tension. Remplacez le filtre orange par un filtre bleu large bande et donnez trois impulsions lumineuses de 5 secondes à intensité maximale.Vérifiez la réponse en tension. Attendez au moins 60 secondes dans l’obscurité. Remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent.Ensuite, donnez deux impulsions lumineuses de 5 secondes avec des intervalles de 60 secondes. Vérifiez la réponse en tension. Pour mesurer le potentiel M de l’ERP, donnez une impulsion de lumière bleue continue jusqu’à ce qu’une réponse de tension en régime permanent soit atteinte.Donnez un bref flash lumineux intense d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nanomètres à l’aide d’un filtre passe-bande de 20 nanomètres. Mesurez ensuite l’amplitude maximale de la phase M1 de la réponse du potentiel M, qui reflète l’absorption de la métarhodopsine à cette longueur d’onde spécifique au photoéquilibre. Les réponses PDA ont été évaluées pour différentes mouches mutantes.Les mouches de type sauvage ont montré une dépolarisation saturée dans l’obscurité qui est apparue comme un ERG cornéen négatif prolongé, à la suite d’une stimulation intense de la lumière bleue. Les lumières bleues suivantes ont produit de petites réponses superposées au PDA, dépourvues des transitoires marche et arrêt. Chez les mouches mutantes présentant une biogenèse photopigmentaire anormale telle que ninaE, la réponse en tension est revenue à la ligne de base après une stimulation intense de la lumière bleue, et la réponse à une lumière bleue supplémentaire n’a pas été supprimée et a montré des transitoires normaux.L’ERP de type sauvage de la mouche est obtenu par le même protocole, mais un flash vert intense est appliqué pendant le PDA. Ce flash vert déclenche l’ERP et supprime le PDA. Le potentiel M a été obtenu par le flash vert après l’éclairage bleu, mais pas par un flash bleu après l’éclairage bleu chez la mouche de type sauvage.Ce protocole a été répété chez les types sauvages, dans les mutations hypomorphes photopigmentaires ninaE, et dans les mutants déficients en phototransduction avec des niveaux normaux de photopigments norpA. Les spectres d’absorption relatifs de la rhodopsine volante et de la métarhodopsine ont été calculés à partir de mesures photométriques du spectre différent et du spectre de photoéquilibre. Il est important pour la survie des mouches de faire attention à la viscosité de la cire en s’abstenant de surchauffe.Cette procédure convient à la génétique et au dépistage des mutants visuels défectueux. Les méthodes qui isolent et identifient au hasard les mutations visuelles peuvent faciliter la découverte de nouvelles protéines et de nouveaux mécanismes impliqués dans la phototransduction de la drosophile. Le protocole PDA a permis d’isoler des mécanismes visuels importants et nouveaux.La participation n’aurait probablement pas été découverte ou même anticipée autrement.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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