Name: targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

يتم تمويل منحة الدكتوراه من S.B. من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH20020) وجامعة السوربون. يتم تمويل منحة الدكتوراه I.T.is من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH18020) وجامعة NMBU النرويجية. وقد تلقى هذا المشروع دعما ماليا من المركز الوطني للبحث العلمي من خلال برامج MITI المتعددة التخصصات. MRic هي عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-10-INBS-04).

1. إنتاج Saccharina latissima gametophytes
<ol><li>جمع النباتات البوغية الناضجة من S. latissima من البرية كما هو موضح سابقا20,21. تأكد من أن النباتات البوغية المختارة خالية من النباتات النباتية (الكائنات الحية الصغيرة المرئية على سطح الشفرة) أو الطفيليات الداخلية ...

<ol>
	<li>Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+studies+of+the+role+of+the+Drosophila+oocyte+nucleus+in+pattern+formation.">Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.</a> Science. 254 (5029), 290-293 (1991).</li><li>Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+to+probe+the+epithelial+mechanics+in+drosophila.">Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila.</a> Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).</li><li>Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+laser+ablation+with+tunable+lesion+size+reveals+multiple+origins+of+seizure-like+convulsions+in+Caenorhabditis+elegans.">Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).</li><li>Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+femtosecond-laser+ablation+of+Xenopus+laevis+melanocytes+for+studies+of+cell+migration,+wound+repair,+and+developmental+processes.">Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).</li><li>Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+and+laser+ablation+analysis+of+leaf+positioning+and+dorsoventral+patterning+in+tomato.">Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato.</a> Development. 132 (1), 15-26 (2005).</li><li>Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+in+Arabidopsis+roots:+a+tool+to+study+cell-to-cell+communication.+Cellular+integration+of+signalling+pathways+in+plant+development.">Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development.</a> Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).</li><li>Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+by+the+cell+wall+in+early+fucus+development.">Cell fate determination by the cell wall in early fucus development.</a> Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).</li><li>Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+dependent+control+of+cell+fate+in+the+Fucus+embryo:+role+of+intercellular+communication.">Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication.</a> Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).</li><li>Bringloe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+the+brown+algae.">Phylogeny and evolution of the brown algae.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).</li><li>Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Hand&#229;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+of+the+brown+seaweed,+saccharina+latissima:+a+review.">Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review.</a> Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).</li><li>Zhang, X., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techno-economic+and+environmental+assessment+of+novel+biorefinery+designs+for+sequential+extraction+of+high-value+biomolecules+from+brown+macroalgae+Laminaria+digitata,+Fucus+vesiculosus,+and+Saccharina+latissima.">Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima.</a> Algal Research. 60, 102499 (2021).</li><li>Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+gametophytes+of+some+japanese+species+of+laminariales.">On the gametophytes of some japanese species of laminariales.</a> Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).</li><li>Fritsch, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).</li><li>Bartsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genus+Laminaria+sensu+lato+:+recent+insights+and+developments.">The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments.</a> European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).</li><li>Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Brown+algae:+ectocarpus+and+saccharina+as+experimental+models+for+developmental+biology.">Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. , 485 (2021).</li><li>Drew, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reproduction+and+early+development+of+laminaria+digitata+and+laminaria+saccharina.">The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina.</a> Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).</li><li>Yendo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+costaria,+undaria,+and+laminaria.">The development of costaria, undaria, and laminaria.</a> Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).</li><li>Forbord, S., Steinhovden, K., R&#248;d, K., Hand&#229;, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+protocol+for+Saccharina+latissima.">Cultivation protocol for Saccharina latissima.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).</li><li>Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+clonal+stock+cultures+and+hybridization+of+kelps.">Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).</li><li>Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+zygotes+and+embryos+of+the+kelp+saccharina+latissima+for+cell+biology+approaches.">Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches.</a> Bio-protocol. 101, 4132 (2021).</li><li>L&#252;ning, K., Dring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+induced+by+blue+light+in+female+gametophytes+of+Laminaria+saccharina.">Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina.</a> Planta. 104 (3), 252-256 (1972).</li><li>de Medeiros, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+manipulation+with+ultrashort+infrared+laser+pulses+in+light-sheet+microscopy.">Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).</li><li>Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tension+at+cell-cell+junctions+using+two-photon+laser+ablation.">Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation.</a> Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).</li><li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+(Phaeophyceae).">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li><li>Rabill&#233;, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brown+algal+mode+of+tip+growth:+Keeping+stress+under+control.">The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control.</a> PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).</li></ol>

يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزماني والمكاني بمستوى عال من الدقة. ومع ذلك ، يمكن أن تعرقل كفاءتها عدم إمكانية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ؛ على سبيل المثال ، جميع الخلايا هي من جنين ثلاثي الأبعاد. تم تطوير هذا البروتوكول على جنين الطحالب Saccharina latissima، التي تطور صف...

تم استخدام الاستئصال بالليزر لعقود لدراسة تطور الجنين. إن تشعيع خلايا الجنين بشعاع ليزر يجعل من الممكن مراقبة إمكانات التجدد وتعديل سلالة الخلية أثناء تكوين الجنين والتحقيق في تأثير الاستئصال المستهدف على انقسام الخلايا ومصير الخلية. الكائنات الحية النموذجية المستخدمة في طرق الاستئصال بالليزر هي عادة ، مثل الحشرات 1,2 ، والديدان الخيطية3,4 ، والفقاريات5,6 ، وأحيانا النباتات 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نهج الاستئصال الدقيق بالليزر على الطحالب البنية Fucus في عامي 1994 و 1998 لإثبات دور جدار الخلية في الاستقطاب الضوئي للجنين المبكر 9,10.
تنتمي الطحالب البنية إلى مجموعة Stramenopiles ، التي تباعدت في جذر شجرة حقيقية النواة منذ 1.6 مليار سنة. ونتيجة لذلك ، فهي مستقلة من الناحية الفيلولوجية عن الكائنات الحية متعددة الخلايا الأخرى ، مثل الحيوانات والنباتات11. ينتمي Saccharina latissima إلى رتبة Laminariales ، والمعروفة أكثر باسم عشب البحر ، وهي من بين أكبر الكائنات الحية على وجه الأرض ، حيث تصل أحجامها إلى أكثر من 30 مترا. Saccharina sp. هي أعشاب بحرية كبيرة تستخدم للعديد من التطبيقات مثل الأغذية والأعلاف ، ويتم استخراج السكريات المتعددة لاستخدامها في الصناعات الزراعية والدوائية والتجميلية في جميع أنحاء العالم12 ، 13. وتتطلب زراعته، وخاصة في آسيا ومؤخرا في أوروبا، إعداد الأجنة في المفرخات قبل إطلاق الأحداث في البحر المفتوح. مثل جميع عشب البحر ، لديها دورة حياة ثنائية الطور تتكون من مرحلة أمشاج مجهرية ، تنمو خلالها أمشاج فردية وتنتج أمشاج للإخصاب ، ومرحلة بوغية مجهرية ثنائية الصبغيات ، حيث تتطور شفرة مستوية كبيرة من ثباتها المرتبط بقاع البحر أو الصخور. يطلق البوغي جراثيم فردية عند النضج ، وبالتالي يكمل دورة الحياة 14،15،16.
يقدم S. latissima بعض الميزات المورفولوجية المثيرة للاهتمام17. يتطور جنينها كورقة مستوية أحادية الطبقات15،18،19 قبل الحصول على بنية متعددة الطبقات تتزامن مع ظهور أنواع مختلفة من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Laminariales هي واحدة من الأصناف الوحيدة من الطحالب البنية التي تظل أجنتها مرتبطة بأنسجتها الأمومية (Desmarestiales و Sporochnales تفعل15 أيضا). توفر هذه الميزة الفرصة لدراسة دور أنسجة الأمهات في هذه العملية التنموية ومقارنة آليات مراقبة الأم في الطحالب البنية مع تلك الموجودة في الحيوانات والنباتات.
تقدم هذه المقالة أول بروتوكول كامل للاستئصال بالليزر في جنين عشب البحر المبكر. ينتج عن هذا البروتوكول الذي يتضمن تقنية نبضات الأشعة فوق البنفسجية NS تدميرا محددا لخلايا الجنين الفردية لدراسة أدوار كل منها أثناء تكوين الجنين. يوفر هذا الإجراء نهجا موثوقا به للتحقيق في تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا أثناء التكوين الجنيني في Laminariales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 mm glass bottom petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved sea water</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Collected offshore near the Astan buoy (48&#176;44.934 N 003&#176;57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>MED 2</td>
			<td>83.3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture cabinets</td>
			<td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td>
			<td></td>
			<td>Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 Zeiss confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359947</td>
			<td>Blue polypropylene (autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Provasoli supplement</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount</td>
			<td>PDSS 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SysCon software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser-driver software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN software</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima

في Saccharina latissima، يتطور الجنين كورقة خلية أحادية الطبقات تسمى الصفيحة أو الشفرة. من السهل ملاحظة كل خلية جنينية ، ويمكن تمييزها بسهولة عن جيرانها ، ويمكن استهدافها بشكل فردي. لعقود من الزمان ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لدراسة تطور الجنين. هنا ، تم تطوير بروتوكول للاستئصال بالليزر الخاص بالخلايا للأجنة المبكرة للطحالب البنية S. latissima. يتضمن العمل المعروض: (1) إعداد أجنة السكرينا ، مع وصف للمعلمات الحرجة ، بما في ذلك ظروف الزرع ، (2) إعدادات الاستئصال بالليزر ، و (3) مراقبة النمو اللاحق للجنين المشعع باستخدام المجهر بفاصل زمني. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تفاصيل حول الظروف المثلى لنقل الأجنة من منصة التصوير إلى المختبر ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل عميق على تطور الجنين اللاحق. الطحالب التي تنتمي إلى رتبة Laminariales تعرض أنماط تكوين جنيني مشابهة ل Saccharina ؛ وبالتالي يمكن نقل هذا البروتوكول بسهولة إلى أنواع أخرى في هذا التصنيف.

نمت النباتات المشيمية من S. latissima ، وتم تحفيز تكوين الأمشاج لإنتاج الزيجوت والأجنة. بعد اثني عشر يوما من تحريض تكوين الأمشاج ، خضعت الأجنة للاستئصال بالليزر. هنا ، تهدف التجربة إلى تقييم دور خلايا محددة في التطور الشامل لأجنة S. latissima. تم استهداف الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاع?...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

تدمير خلايا معينة في الجنين هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الخلوية المشاركة في مصير الخلية. يصف هذا البروتوكول تقنيات الاستئصال بالليزر للخلايا المستهدفة في الجنين المبكر للطحالب البنية Saccharina latissima.

الاستئصال بالليزر المستهدف في جنين السكرينا لاتيسيما

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

هذا البروتوكول هو أول بروتوكول استئصال كامل بالليزر على جنين عشب البحر المبكر. يوفر الإجراء نهجا موثوقا به في التحقيق في مصير الخلية والتفاعل أثناء التكوين الجنيني في الطحالب البنية. يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزمني والخاص بمستوى عال من الدقة والأنسجة على الخلايا.هذا النهج هو طريقة واعدة لدراسة مصائر الخلايا والتفاعل في الجنين المبكر للطحالب البنية. يمكن تطبيقه على أنظمة الطحالب الأخرى مع تغييرات قليلة. ابدأ بتصوير طبق بتري بأكمله لتحديد موقع الأجنة للاختيار أثناء خطوة الاستئصال ومراقبة التطور اللاحق للأجنة المختارة.ابدأ فحص البلاط. سجل موضع النقاط الأساسية الأربع لطبق بيتري. أدخل المعلمات كما هو محدد في مخطوطة النص واحصل على صور مرسلة أو فلورية لطبق بتري بأكمله بدقة منخفضة.احفظ صورة المسح الضوئي للتجانب واجعلها مفتوحة في نافذة برنامج الحصول على الصور. تغيير الهدف دون إزالة طبق بيتري. ابحث عن الأجنة ذات الأهمية في الفحص.لمعايرة الليزر، افتح برنامج تشغيل الليزر وحزمة برامج الحصول على الصور. ثم تهيئة مسار الليزر. قم بمزامنة كلتا حزمتي البرامج بالنقر فوق بدء الاستحواذ في حزمة برامج تشغيل الليزر.قم بإعداد المعلمات للاستئصال بالليزر وانقر على البث المباشر. حدد منطقة فارغة على الطبق واخفض مستوى المرحلة إلى 20 ميكرومتر تحت السطح العلوي لطبق بتري للتركيز على الجزء السفلي الزجاجي. للعثور على مجال اهتمام من خلال النقر على زر اختيار AOI والنقر على حواف الصورة في حزمة برامج تشغيل الليزر فوق البنفسجي.انقر فوق بدء المعايرة وحدد المعايرة اليدوية لتعيين مسارات ليزر الاستئصال والتصوير بالليزر. تأكد من أن جميع المصاريع مفتوحة. حدد طاقة ليزر عالية بما يكفي لرؤية نقطة سوداء في وسط الصورة الحية المقابلة للثقب الموجود في انزلاق الغطاء الزجاجي.انقر فوق النقطة السوداء المركزية باستخدام مؤشر الماوس وحدد 18 نقطة إضافية يقترحها البرنامج لإكمال إجراء المحاذاة. انقر على وضع النقر والنار. تحقق من المعايرة على نفس شريحة الغطاء وانقر على الطبقة الزجاجية حيث يكون تأثير الليزر مرئيا.حدد جنينا ذا أهمية في مسح البلاط وحرك المرحلة بالنقر فوقه. ابدأ السلسلة الزمنية. اختبار معلمات الفاصل الزمني في البث المباشر وضبطها إذا لزم الأمر.ابدأ تسجيل الفاصل الزمني في برنامج الحصول على الصور بأقصى سرعة. اضبط التكبير/التصغير للتركيز على مجال الاهتمام وتصور الجنين بأكمله. لمتابعة الجنين أثناء تسجيل الاستئصال ، انقر فوق الزر ، واحصل على أحدث صورة.اضبط المعلمات على إرسال ليزر بنسبة 45٪ تتوافق مع 40 ميكروواط كحد أقصى ومدة زمنية واحدة للنبض بالمللي ثانية. تطبيق التشعيع الضار على الخلايا الجنينية ذات الأهمية باستخدام برنامج تشغيل الليزر انقر ووظيفة النار. تحت 688 نانومتر ، راقب طرد البلاستيدات الخضراء ذاتية الفلورسنت من السيتوبلازم.إذا بقيت محتويات الخلية في الخلية، فاستخدم وظيفة النقر وإطلاق النار مرة أخرى لزيادة حجم الخرق في الخلية. كرر هذه العملية حتى يتم تحرير معظم محتويات الخلية، مع الحفاظ على عدد اللقطات إلى الحد الأدنى. أوقف تسجيل الفاصل الزمني بعد استقرار الجنين وعدم اكتشاف أي حركة أخرى بين الخلايا.قم بتحديث التعليق التوضيحي على صورة مسح التجانب ضوئيا، والكتابة فوق فحص التجانب الموجود، وحفظ الصورة. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة عدد الأجنة التي تتطور بعد الاستئصال بالليزر ومقارنتها بتلك التي تموت. تحديد تأخر النمو عن طريق قياس طول الأجنة الملتقطة بالليزر كل يوم ومقارنتها بالأجنة السليمة.ابحث عن الضرر المجاور من خلال مراقبة تفاعل الخلايا المجاورة للخلايا الممزقة. كانت الخلايا المستهدفة ذات الأهمية هي الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاعدية الأكثر ، والخلايا المتوسطة. بعد مسح البلاط لطبق بتري بأكمله ، تم تحديد جنين مثير للاهتمام كمرشح مناسب للتصوير بالليزر.أطلقت الخلية محتوياتها عند إطلاقها بشعاع ليزر نبضي بالأشعة فوق البنفسجية بقوة 45٪ ، في حين توسعت الخلية المجاورة للخلايا المشععة في الفضاء بين الخلايا. تم تسجيل موضع الأجنة المشععة كل 24 ساعة لمدة 10 أيام. استمرت معظم الأجنة المشععة في التطور ولكنها أظهرت تغييرا في النمو.في المقابل، سرعان ما أظهرت الأجنة التي تم اختبارها باستخدام معلمات الليزر الأخرى علامات الإجهاد الشديد مثل تبييض الخلايا أو تلاشيها أو تغيير شكلها. تقريبا جميع الأجنة التي تم إطلاق النار عليها بهذه الطريقة ماتت في غضون خمسة أيام بعد التجربة. يجب عدم تغيير بعض المعلمات، مثل تنسيق الصورة أو التكبير/التصغير بعد المعايرة.مطلوب مراقبة أثناء وبعد الاستئصال بالليزر للحصول على نظرة ثاقبة على ما حدث. يمهد الاستئصال بالليزر الطريق لاكتشافات جديدة في الدراسة التنموية للطحالب البنية وفهم أكثر عمقا لتفاعلات المستقلبات المختلفة أو مكونات خلاياها.

targeted-laser-ablation-in-the-embryo-of-saccharina-latissima

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

فعالية "تجريد الهواء" في "اثنين من أسماك السلمون"، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus Mykiss) وسمك السلمون المرقط البنى (Salmo Trutta مورفى فريو)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...