Name: targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

S.B.'s ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-bevillingsnummer COH20020) og Sorbonne Université. I.T.is ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-tilskudsnummer COH18020) og Norvegian NMBU University. Dette projekt har modtaget økonomisk støtte fra CNRS gennem MITI tværfaglige programmer. MRic er medlem af den nationale infrastruktur France-BioImaging støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04).

1. Produktion af Saccharina latissima gametofytter
<ol><li>Saml modne sporofytter af S. latissima fra naturen som tidligere beskrevet20,21. Sørg for, at de valgte sporofytter er blottet for epifytter (små organismer synlige på bladets overflade) eller interne parasitter (findes i de blegede områder eller pletter på bladet). 
</li>
	<li>Brug en skalpel til at skære den mørkeste del i midten af bladet (frugtbart ...

<ol>
	<li>Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+studies+of+the+role+of+the+Drosophila+oocyte+nucleus+in+pattern+formation.">Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.</a> Science. 254 (5029), 290-293 (1991).</li><li>Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+to+probe+the+epithelial+mechanics+in+drosophila.">Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila.</a> Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).</li><li>Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+laser+ablation+with+tunable+lesion+size+reveals+multiple+origins+of+seizure-like+convulsions+in+Caenorhabditis+elegans.">Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).</li><li>Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+femtosecond-laser+ablation+of+Xenopus+laevis+melanocytes+for+studies+of+cell+migration,+wound+repair,+and+developmental+processes.">Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).</li><li>Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+and+laser+ablation+analysis+of+leaf+positioning+and+dorsoventral+patterning+in+tomato.">Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato.</a> Development. 132 (1), 15-26 (2005).</li><li>Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+in+Arabidopsis+roots:+a+tool+to+study+cell-to-cell+communication.+Cellular+integration+of+signalling+pathways+in+plant+development.">Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development.</a> Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).</li><li>Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+by+the+cell+wall+in+early+fucus+development.">Cell fate determination by the cell wall in early fucus development.</a> Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).</li><li>Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+dependent+control+of+cell+fate+in+the+Fucus+embryo:+role+of+intercellular+communication.">Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication.</a> Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).</li><li>Bringloe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+the+brown+algae.">Phylogeny and evolution of the brown algae.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).</li><li>Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Hand&#229;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+of+the+brown+seaweed,+saccharina+latissima:+a+review.">Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review.</a> Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).</li><li>Zhang, X., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techno-economic+and+environmental+assessment+of+novel+biorefinery+designs+for+sequential+extraction+of+high-value+biomolecules+from+brown+macroalgae+Laminaria+digitata,+Fucus+vesiculosus,+and+Saccharina+latissima.">Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima.</a> Algal Research. 60, 102499 (2021).</li><li>Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+gametophytes+of+some+japanese+species+of+laminariales.">On the gametophytes of some japanese species of laminariales.</a> Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).</li><li>Fritsch, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).</li><li>Bartsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genus+Laminaria+sensu+lato+:+recent+insights+and+developments.">The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments.</a> European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).</li><li>Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Brown+algae:+ectocarpus+and+saccharina+as+experimental+models+for+developmental+biology.">Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. , 485 (2021).</li><li>Drew, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reproduction+and+early+development+of+laminaria+digitata+and+laminaria+saccharina.">The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina.</a> Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).</li><li>Yendo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+costaria,+undaria,+and+laminaria.">The development of costaria, undaria, and laminaria.</a> Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).</li><li>Forbord, S., Steinhovden, K., R&#248;d, K., Hand&#229;, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+protocol+for+Saccharina+latissima.">Cultivation protocol for Saccharina latissima.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).</li><li>Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+clonal+stock+cultures+and+hybridization+of+kelps.">Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).</li><li>Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+zygotes+and+embryos+of+the+kelp+saccharina+latissima+for+cell+biology+approaches.">Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches.</a> Bio-protocol. 101, 4132 (2021).</li><li>L&#252;ning, K., Dring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+induced+by+blue+light+in+female+gametophytes+of+Laminaria+saccharina.">Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina.</a> Planta. 104 (3), 252-256 (1972).</li><li>de Medeiros, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+manipulation+with+ultrashort+infrared+laser+pulses+in+light-sheet+microscopy.">Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).</li><li>Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tension+at+cell-cell+junctions+using+two-photon+laser+ablation.">Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation.</a> Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).</li><li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+(Phaeophyceae).">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li><li>Rabill&#233;, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brown+algal+mode+of+tip+growth:+Keeping+stress+under+control.">The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control.</a> PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).</li></ol>

Lokal cellulær laserablation giver mulighed for tidsmæssig og rumlig ablation med et højt præcisionsniveau. Dets effektivitet kan imidlertid hæmmes af målcellernes manglende tilgængelighed; for eksempel er alle cellerne af et tredimensionelt embryo. Denne protokol blev udviklet på embryoet af algen Saccharina latissima, som udvikler en enlags lamina, hvor alle celler let kan skelnes og ødelægges individuelt med en laserstråle.
Laserkraft og bølgelængde<br...

Laserablation er blevet brugt i årtier til at studere embryoudvikling. Bestråling af embryoceller med en laserstråle gør det muligt at overvåge det regenerative potentiale og modifikationen af celleslægten under embryogenese og undersøge virkningen af målrettet ablation på celledeling og celleskæbne. De modelorganismer, der anvendes i laserablationsmetoder, er typisk dyr, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, hvirveldyr 5,6 og lejlighedsvis planter 7,8. Derudover blev en lasermikroablationsmetode anvendt på den brune alge Fucus i 1994 og 1998 for at demonstrere cellevæggens rolle i fotopolariseringen af det tidlige embryo 9,10.
Brune alger tilhører gruppen Stramenopiles, divergerede ved roden af det eukaryote træ for 1,6 milliarder år siden. Som følge heraf er de fylogenetisk uafhængige af andre flercellede organismer, såsom dyr og planter11. Saccharina latissima tilhører ordren Laminariales, mere almindeligt kendt som kelps, og de er blandt de største organismer på jorden og når størrelser på over 30 m. Saccharina sp. er en stor tang, der anvendes til mange anvendelser såsom mad og foder, og dets polysaccharider ekstraheres til brug i landbrugs-, farmakologiske og kosmetiske industrier over hele verden12, 13. Dens dyrkning, hovedsagelig i Asien og for nylig i Europa, kræver forberedelse af embryoner i rugerier, inden unge frigives i det åbne hav. Som alle tang har den en bifasisk livscyklus sammensat af en mikroskopisk gametofytisk fase, hvor en haploid gametofyt vokser og producerer gameter til befrugtning og en diploid makroskopisk sporofytisk fase, hvor et stort plant blad udvikler sig fra sin holdfast fastgjort til havbunden eller klipperne. Sporofytten frigiver haploide sporer ved modenhed og fuldender derved livscyklussen 14,15,16.
S. latissima præsenterer nogle interessante morfologiske træk17. Dets embryo udvikler sig som et enkeltlags planark 15,18,19, før det erhverver en flerlagsstruktur, der falder sammen med fremkomsten af forskellige vævstyper. Derudover er Laminariales en af de eneste taxa af brune alger, hvis embryoner forbliver bundet til deres moderlige gametofytiske væv (Desmarestiales og Sporochnales gør også15). Denne funktion giver mulighed for at studere moderens vævs rolle i denne udviklingsproces og sammenligne moderlige kontrolmekanismer i brune alger med dem hos dyr og planter.
Denne artikel præsenterer den første komplette protokol for laserablation i et tidligt kelpembryo. Denne protokol, der involverer UV ns-pulserende teknik, resulterer i specifik destruktion af individuelle embryoceller for at studere deres respektive roller under embryogenese. Proceduren tilbyder en pålidelig tilgang til undersøgelse af celleinteraktioner og celle skæbne under embryogenese i Laminariales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 mm glass bottom petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved sea water</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Collected offshore near the Astan buoy (48&#176;44.934 N 003&#176;57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>MED 2</td>
			<td>83.3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture cabinets</td>
			<td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td>
			<td></td>
			<td>Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 Zeiss confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359947</td>
			<td>Blue polypropylene (autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Provasoli supplement</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount</td>
			<td>PDSS 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SysCon software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser-driver software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN software</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima

I Saccharina latissima udvikler embryoet sig som et enlags celleark kaldet lamina eller bladet. Hver embryocelle er let at observere, let at skelne fra sine naboer og kan målrettes individuelt. I årtier er laserablation blevet brugt til at studere embryoudvikling. Her blev der udviklet en protokol for cellespecifik laserablation til tidlige embryoner af den brune alge S. latissima. Det præsenterede arbejde omfatter: (1) fremstilling af Saccharina-embryoner med en beskrivelse af de kritiske parametre, herunder kulturbetingelser, (2) laserablationsindstillingerne og (3) overvågning af den efterfølgende vækst af det bestrålede embryo ved hjælp af timelapse-mikroskopi. Derudover gives detaljer om de optimale betingelser for transport af embryonerne fra billeddannelsesplatformen tilbage til laboratoriet, hvilket kan påvirke den efterfølgende embryoudvikling dybt. Alger, der tilhører ordenen Laminariales, viser embryogenesemønstre svarende til Saccharina; denne protokol kan således let overføres til andre arter i denne taxon.

Gametofytter af S. latissima blev dyrket, og gametogenese blev induceret til at producere zygoter og embryoner. Tolv dage efter induktionen af gametogenese gennemgik embryonerne laserablation. Her havde eksperimentet til formål at vurdere specifikke cellers rolle i den samlede udvikling af S. latissima-embryoner . Den mest apikale celle, den mest basale celle og mediancellerne blev målrettet. Efter flisescanning blev hele petriskålen (figur 2A), et embryo af interesse, i...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Ødelæggelsen af specifikke celler i embryoet er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære interaktioner involveret i celle skæbne. Den nuværende protokol beskriver teknikker til laserablation af målrettede celler i det tidlige embryo af den brune alge Saccharina latissima.

Målrettet laserablation i embryoet af Saccharina latissima

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

Denne protokol er den første komplette laserablationsprotokol på tidligt kelpembryo. Proceduren giver en pålidelig tilgang til undersøgelse af celle skæbne og interaktion under embryogenese i brune alger. Lokal cellulær laserablation giver mulighed for tidsmæssig og speciel ablation med et højt niveau af præcision og væv på celler.Denne tilgang er en lovende metode til at studere celleskæbner og interaktion i det tidlige embryo af brune alger. Det kan anvendes på andre algesystemer med få ændringer. Begynd med at afbilde hele petriskålen for at lokalisere embryonerne til udvælgelse under ablationstrinnet og overvåge den efterfølgende udvikling af de valgte embryoner.Start feltscanningen. Registrer placeringen af de fire kardinalpunkter i Petriskålen. Indtast parametrene som defineret i tekstmanuskriptet, og anskaf transmitterede eller fluorescerende billeder af hele petriskålen i lav opløsning.Gem flisescanningsbilledet, og hold det åbent i softwarevinduet til billedoptagelse. Skift målet uden at fjerne petriskålen. Find embryoner af interesse på scanningen.For at kalibrere laseren skal du åbne softwarepakken til laserdriver og billedoptagelse. Initialiser derefter laserstien. Synkroniser begge softwarepakker ved at klikke på start anskaffelse i laserdriverens softwarepakke.Indstil parametrene for laserablation, og klik på live. Vælg et tomt område på fadet, og sænk sceneniveauet til 20 mikrometer under petriskålens øverste overflade for at fokusere på glasbunden. For at finde et interesseområde ved at klikke på vælg AOI-knappen og klikke på kanterne af billedet i UV-laserdriversoftwarepakken.Klik på start kalibrering og vælg manuel kalibrering for at indstille ablationslaser- og billedlaserbanerne. Sørg for, at alle skodder er åbne. Vælg en lasereffekt, der er høj nok til at se en sort prik i midten af det levende billede, der svarer til hullet i glasdækslet.Klik på den centrale sorte prik med musemarkøren, og vælg 18 yderligere prikker foreslået af softwaren for at fuldføre justeringsproceduren. Klik på klik- og brandtilstand. Kontroller kalibreringen på den samme dækslip, og klik på det glaslag, hvor laserpåvirkningen er synlig.Vælg et embryo af interesse på flisescanningen og flyt scenen ved at klikke på den. Start tidsserien. Test time lapse-parametre i live, og juster om nødvendigt.Start en timelapse-optagelse i billedoptagelsessoftwaren med den maksimale hastighed. Juster zoomen for at fokusere på interesseområdet og visualisere hele embryoet. For at følge embryoet under optagelsen af ablation skal du klikke på knappen, erhverve det nyeste billede.Indstil parametrene til 45% lasertransmission svarende til maksimalt 40 mikrowatt og en millisekunds pulstidsvarighed. Anvend den skadelige bestråling på embryocellerne af interesse ved hjælp af laserdriversoftwaren klik- og brandfunktion. Under 688 nanometer skal du overvåge den autofluorescerende kloroplastudstødning fra cytoplasmaet.Hvis celleindholdet forbliver i cellen, skal du bruge klik- og brandfunktionen igen for at øge størrelsen på bruddet i cellen. Gentag denne proces, indtil det meste af celleindholdet frigives, og hold antallet af skud på et minimum. Stop time lapse-registreringen, efter at embryoet er stabiliseret, og der kan ikke påvises yderligere intercellulær bevægelse.Opdater anmærkningen på feltscanningsbilledet, overskriv den eksisterende feltscanning, og gem billedet. Bestem overlevelsesraten ved at overvåge antallet af embryoner, der udvikler sig efter laserablation, og sammenlign dem med dem, der dør. Bestem vækstforsinkelsen ved at måle længden af de laserskudte embryoner hver dag og sammenligne den med intakte embryoner.Find den tilstødende skade ved at overvåge reaktionen af celler, der støder op til de ablerede celler. Målrettede celler af interesse var den mest apikale celle, den mest basale celle og mediancellerne. Efter flisescanning af hele petriskålen blev et embryo af interesse identificeret som en egnet kandidat til laserskydning.Cellen frigav sit indhold, når det blev skudt med en puls UV-laserstråle ved 45% effekt, mens en celle ved siden af de bestrålede celler udvidede sig ind i det intercellulære rum. Placeringen af de bestrålede embryoner blev registreret hver 24. time i 10 dage. De fleste af de bestrålede embryoner fortsatte med at udvikle sig, men viste vækstændring.I modsætning hertil viste embryoner testet med andre laserparametre hurtigt tegn på alvorlig stress såsom celleblegning, fading eller formændringer. Næsten alle embryoner skudt på denne måde døde inden for fem dage efter eksperimentet. Nogle parametre, f.eks. billedformat eller zoom, bør ikke ændres efter kalibrering.Overvågning under og efter laserablation er påkrævet for at have indsigt i, hvad der skete. Laserablation baner vejen for nye opdagelser i udviklingsstudiet af brunalger og en dybere forståelse af interaktioner mellem forskellige metabolitter eller komponenter i deres celler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikroperle Implantation i Zebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjektion og Elektroporering i Chordatzoologi<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Kirurgisk Ablation Assay for studere Eye Regeneration i planarier

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Effektiviteten af luft Stripping i to laksefisk fisk, Regnbueørred (Oncorhynchus Mykiss) og ørred (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In vitro rekonstitution af Rumcelle kontakt mønstre med isolerede Caenorhabditis elegans embryo blastomeres og klæbende polystyren perler

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Konfokal mikroskop-baserede laser ablation og regenerering assay i zebrafisk interneuromast celler

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...