Name: targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

Das PhD-Stipendium von S.B. wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH20020) und der Sorbonne Université finanziert. I.T.is PhD-Stipendium wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH18020) und der Norvegian NMBU University finanziert. Dieses Projekt wurde vom CNRS durch die interdisziplinären MITI-Programme finanziell unterstützt. MRic ist Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-10-INBS-04) unterstützt wird.

1. Produktion von Saccharina latissima Gametophyten
<ol><li>Sammle reife Sporophyten von S. latissima aus der Wildnis wie zuvor beschrieben20,21. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Sporophyten frei von Epiphyten (kleine Organismen, die auf der Oberfläche der Klinge sichtbar sind) oder inneren Parasiten (in den gebleichten Bereichen oder Flecken auf der Klinge) sind. 
</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Skalpel...

<ol>
	<li>Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+studies+of+the+role+of+the+Drosophila+oocyte+nucleus+in+pattern+formation.">Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.</a> Science. 254 (5029), 290-293 (1991).</li><li>Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+to+probe+the+epithelial+mechanics+in+drosophila.">Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila.</a> Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).</li><li>Bargmann, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).</li><li>Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. 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Cellular integration of signalling pathways in plant development.</a> Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).</li><li>Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+by+the+cell+wall+in+early+fucus+development.">Cell fate determination by the cell wall in early fucus development.</a> Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).</li><li>Bouget, F. 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G., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+zygotes+and+embryos+of+the+kelp+saccharina+latissima+for+cell+biology+approaches.">Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches.</a> Bio-protocol. 101, 4132 (2021).</li><li>L&#252;ning, K., Dring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+induced+by+blue+light+in+female+gametophytes+of+Laminaria+saccharina.">Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina.</a> Planta. 104 (3), 252-256 (1972).</li><li>de Medeiros, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+manipulation+with+ultrashort+infrared+laser+pulses+in+light-sheet+microscopy.">Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).</li><li>Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tension+at+cell-cell+junctions+using+two-photon+laser+ablation.">Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation.</a> Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).</li><li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+(Phaeophyceae).">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li><li>Rabill&#233;, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brown+algal+mode+of+tip+growth:+Keeping+stress+under+control.">The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control.</a> PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).</li></ol>

Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und räumliche Ablation mit hoher Präzision. Seine Effizienz kann jedoch durch die Nichtzugänglichkeit von Zielzellen beeinträchtigt werden; Zum Beispiel sind alle Zellen von einem dreidimensionalen Embryo. Dieses Protokoll wurde am Embryo der Alge Saccharina latissima entwickelt, die eine einschichtige Lamina entwickelt, in der alle Zellen leicht identifiziert und einzeln mit einem Laserstrahl zerstört werden können.
<p class="jove_content"...

Die Laserablation wird seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Die Bestrahlung von Embryozellen mit einem Laserstrahl ermöglicht es, das Regenerationspotenzial und die Veränderung der Zelllinie während der Embryogenese zu überwachen und den Einfluss einer gezielten Ablation auf die Zellteilung und das Zellschicksal zu untersuchen. Die Modellorganismen, die in Laserablationsmethoden verwendet werden, sind typischerweise Tiere, wie Insekten 1,2, Nematoden 3,4, Wirbeltiere 5,6 und gelegentlich Pflanzen 7,8. Darüber hinaus wurde 1994 und 1998 ein Laser-Mikroablationsansatz an der Braunalge Fucus verwendet, um die Rolle der Zellwand bei der Photopolarisation des frühen Embryos 9,10 zu demonstrieren.
Braunalgen gehören zur Gruppe der Stramenopiles, die sich vor 1,6 Milliarden Jahren an der Wurzel des eukaryotischen Baumes abspalteten. Dadurch sind sie phylogenetisch unabhängig von anderen vielzelligen Organismen wie Tieren und Pflanzen11. Saccharina latissima gehört zur Ordnung der Laminariales, besser bekannt als Seetang, und sie gehören zu den größten Organismen der Erde und erreichen Größen von über 30 m. Saccharina sp. ist eine große Alge, die für viele Anwendungen wie Lebens- und Futtermittel verwendet wird, und ihre Polysaccharide werden für den Einsatz in der landwirtschaftlichen, pharmakologischen und kosmetischen Industrie weltweit extrahiert12, 13. Seine Kultivierung, hauptsächlich in Asien und in jüngster Zeit in Europa, erfordert die Vorbereitung von Embryonen in Brütereien, bevor Jungtiere im offenen Meer freigelassen werden. Wie alle Seetange hat es einen biphasischen Lebenszyklus, der aus einer mikroskopisch kleinen gametophytischen Phase besteht, in der ein haploider Gametophyt wächst und Gameten zur Befruchtung produziert, und einer diploiden makroskopischen sporophytischen Phase, in der sich eine große planare Klinge entwickelt, die von ihrem Festhalten am Meeresboden oder an Felsen befestigt ist. Der Sporophyt setzt bei der Reife haploide Sporen frei und schließt damit den Lebenszyklus14,15,16 ab.
S. latissima weist einige interessante morphologische Merkmaleauf 17. Sein Embryo entwickelt sich als einschichtiges planares Blatt15,18,19, bevor es eine mehrschichtige Struktur annimmt, die mit der Entstehung verschiedener Gewebetypen zusammenfällt. Darüber hinaus ist Laminariales eines der wenigen Taxa von Braunalgen, deren Embryonen an ihrem mütterlichen Gametophytengewebe haften bleiben (Desmarestiales und Sporochnales tun dies auch15). Dieses Feature bietet die Möglichkeit, die Rolle des mütterlichen Gewebes in diesem Entwicklungsprozess zu untersuchen und die mütterlichen Kontrollmechanismen in Braunalgen mit denen in Tieren und Pflanzen zu vergleichen.
Dieser Artikel stellt das erste vollständige Protokoll für die Laserablation in einem frühen Seetangembryo vor. Dieses Protokoll mit UV-ns-gepulster Technik führt zur spezifischen Zerstörung einzelner Embryozellen, um ihre jeweilige Rolle während der Embryogenese zu untersuchen. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung von Zellinteraktionen und Zellschicksal während der Embryogenese in Laminariales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 mm glass bottom petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved sea water</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Collected offshore near the Astan buoy (48&#176;44.934 N 003&#176;57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>MED 2</td>
			<td>83.3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture cabinets</td>
			<td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td>
			<td></td>
			<td>Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 Zeiss confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359947</td>
			<td>Blue polypropylene (autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Provasoli supplement</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount</td>
			<td>PDSS 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SysCon software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser-driver software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN software</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima

Bei Saccharina latissima entwickelt sich der Embryo als einschichtiges Zellblatt, das als Lamina oder Klinge bezeichnet wird. Jede Embryozelle ist leicht zu beobachten, leicht von ihren Nachbarn zu unterscheiden und kann individuell anvisiert werden. Seit Jahrzehnten wird die Laserablation zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Hier wurde ein Protokoll zur zellspezifischen Laserablation für frühe Embryonen der Braunalge S. latissima entwickelt. Die vorgestellte Arbeit umfasst: (1) die Vorbereitung von Saccharina-Embryonen mit einer Beschreibung der kritischen Parameter, einschließlich der Kulturbedingungen, (2) die Laserablationseinstellungen und (3) die Überwachung des nachfolgenden Wachstums des bestrahlten Embryos mittels Zeitraffermikroskopie. Darüber hinaus werden Details zu den optimalen Bedingungen für den Transport der Embryonen von der Bildgebungsplattform zurück ins Labor gegeben, was die spätere Embryonalentwicklung tiefgreifend beeinflussen kann. Algen aus der Ordnung der Laminariales weisen ähnlich wie Saccharina ähnliche Embryogenesemuster auf; dieses Protokoll lässt sich somit leicht auf andere Arten in diesem Taxon übertragen.

Gametophyten von S. latissima wurden gezüchtet, und die Gametogenese wurde induziert, um Zygoten und Embryonen zu produzieren. Zwölf Tage nach der Induktion der Gametogenese unterzogen sich die Embryonen einer Laserablation. Hier zielte das Experiment darauf ab, die Rolle bestimmter Zellen in der Gesamtentwicklung von S. latissima-Embryonen zu bewerten. Die apikalste Zelle, die basalste Zelle und die medianen Zellen wurden ins Visier genommen. Nach dem Scannen der Fliesen wurde die gesamte Petrischale...

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Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Die Zerstörung bestimmter Zellen im Embryo ist ein mächtiges Werkzeug, um zelluläre Interaktionen zu untersuchen, die am Zellschicksal beteiligt sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt Techniken zur Laserablation von Zielzellen im frühen Embryo der Braunalge Saccharina latissima.

Gezielte Laserablation im Embryo von Saccharina latissima

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

Dieses Protokoll ist das erste vollständige Laserablationsprotokoll am frühen Seetang-Embryo. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung des Zellschicksals und der Interaktion während der Embryogenese in Braunalgen. Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und spezielle Ablation mit hoher Präzision und Gewebe auf Zellen.Dieser Ansatz ist eine vielversprechende Methode, um Zellschicksale und Wechselwirkungen im frühen Embryo von Braunalgen zu untersuchen. Es kann mit wenigen Änderungen auf andere Algensysteme angewendet werden. Beginnen Sie mit der Abbildung der gesamten Petrischale, um die Embryonen für die Selektion während des Ablationsschritts zu lokalisieren und die nachfolgende Entwicklung der ausgewählten Embryonen zu überwachen.Starten Sie den Kachelscan. Notieren Sie sich die Position der vier Himmelsrichtungen der Petrischale. Geben Sie die im Textmanuskript definierten Parameter ein und erfassen Sie durchgelassene oder fluoreszierende Bilder der gesamten Petrischale in niedriger Auflösung.Speichern Sie das Kachelscanbild und lassen Sie es im Fenster der Bildaufnahmesoftware geöffnet. Ändern Sie das Ziel, ohne die Petrischale zu entfernen. Finden Sie Embryonen von Interesse auf dem Scan.Um den Laser zu kalibrieren, öffnen Sie den Lasertreiber und das Softwarepaket für die Bildaufnahme. Initialisieren Sie dann den Laserpfad. Synchronisieren Sie beide Softwarepakete, indem Sie im Lasertreiber-Softwarepaket auf Erfassung starten klicken.Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein und klicken Sie auf live. Wählen Sie einen leeren Bereich auf der Schale und senken Sie die Bühnenebene auf 20 Mikrometer unter die Oberseite der Petrischale, um sich auf den Glasboden zu konzentrieren. Um einen Interessenbereich zu finden, klicken Sie auf die Schaltfläche AOI auswählen und klicken Sie auf die Bildränder im UV-Lasertreiber-Softwarepaket.Klicken Sie auf Kalibrierung starten und wählen Sie Manuelle Kalibrierung, um die Ablationslaser- und Bildgebungslasertrajektorien einzustellen. Stellen Sie sicher, dass alle Rollläden geöffnet sind. Wählen Sie eine Laserleistung, die hoch genug ist, um einen schwarzen Punkt in der Mitte des Livebildes zu sehen, der dem Loch im Glasdeckel entspricht.Klicken Sie mit dem Mauszeiger auf den zentralen schwarzen Punkt und wählen Sie 18 zusätzliche Punkte aus, die von der Software vorgeschlagen werden, um den Ausrichtungsvorgang abzuschließen. Klicken Sie auf den Klick- und Feuermodus. Überprüfen Sie die Kalibrierung auf demselben Deckglas und klicken Sie auf die Glasschicht, auf der der Laseraufprall sichtbar ist.Wählen Sie einen Embryo von Interesse auf dem Kachel-Scan aus und bewegen Sie das Stadium, indem Sie darauf klicken. Starten Sie die Zeitreihe. Testen Sie die Zeitrafferparameter live und passen Sie sie bei Bedarf an.Starten Sie eine Zeitrafferaufnahme in der Bildaufnahmesoftware mit maximaler Geschwindigkeit. Passen Sie den Zoom an, um sich auf den interessierenden Bereich zu konzentrieren und den gesamten Embryo zu visualisieren. Um den Embryo während der Aufzeichnung der Ablation zu verfolgen, klicken Sie auf die Schaltfläche, um das neueste Bild aufzunehmen.Stellen Sie die Parameter auf 45% Laserübertragung ein, was einem Maximum von 40 Mikrowatt und einer Pulszeitdauer von einer Millisekunde entspricht. Wenden Sie die schädliche Bestrahlung auf die interessierenden Embryozellen an, indem Sie die Klick- und Feuerfunktion der Lasertreibersoftware verwenden. Überwachen Sie unter 688 Nanometern den Ausstoß autofluoreszierender Chloroplasten aus dem Zytoplasma.Wenn der Zellinhalt in der Zelle verbleibt, verwenden Sie die Klick- und Feuerfunktion erneut, um die Größe des Verstoßes in der Zelle zu erhöhen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Zellinhalts freigegeben ist, und halten Sie die Anzahl der Schüsse auf ein Minimum. Stoppen Sie die Zeitrafferaufzeichnung, nachdem sich der Embryo stabilisiert hat und keine weitere interzelluläre Bewegung festgestellt werden kann.Aktualisieren Sie die Anmerkungen auf dem Kachelscanbild, überschreiben Sie den vorhandenen Kachelscan, und speichern Sie das Bild. Bestimmen Sie die Überlebensrate, indem Sie die Anzahl der Embryonen überwachen, die sich nach der Laserablation entwickeln, und vergleichen Sie sie mit denen, die sterben. Bestimmen Sie die Wachstumsverzögerung, indem Sie jeden Tag die Länge der lasergeschossenen Embryonen messen und mit intakten Embryonen vergleichen.Finden Sie den angrenzenden Schaden, indem Sie die Reaktion von Zellen überwachen, die an die abgetragenen Zellen angrenzen. Zielzellen von Interesse waren die apikalste Zelle, die basalste Zelle und die medianen Zellen. Nach dem Scannen der gesamten Petrischale wurde ein interessanter Embryo als geeigneter Kandidat für das Laserschießen identifiziert.Die Zelle setzte ihren Inhalt frei, wenn sie mit einem Puls-UV-Laserstrahl mit 45% Leistung aufgenommen wurde, während sich eine Zelle neben den bestrahlten Zellen in den Interzellularraum ausdehnte. Die Position der bestrahlten Embryonen wurde alle 24 Stunden für 10 Tage aufgezeichnet. Die meisten der bestrahlten Embryonen entwickelten sich weiter, zeigten aber eine Wachstumsveränderung.Im Gegensatz dazu zeigten Embryonen, die mit anderen Laserparametern getestet wurden, schnell Anzeichen von starkem Stress wie Zellbleichen, Verblassen oder Formveränderungen. Fast alle auf diese Weise geschossenen Embryonen starben innerhalb von fünf Tagen nach dem Experiment. Einige Parameter wie Bildformat oder Zoom sollten nach der Kalibrierung nicht verändert werden.Eine Überwachung während und nach der Laserablation ist erforderlich, um einen Einblick in das Geschehene zu erhalten. Die Laserablation ebnet den Weg für neue Entdeckungen in der Entwicklungsstudie von Braunalgen und ein tieferes Verständnis der Wechselwirkungen verschiedener Metaboliten oder Bestandteile ihrer Zellen.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...