Name: targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

מענק הדוקטורט של S.B. ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH20020) ואוניברסיטת סורבון. מענק הדוקטורט I.T.is ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH18020) ואוניברסיטת NMBU הנורווגית. פרויקט זה קיבל תמיכה כספית מה- CNRS באמצעות התוכניות הבין-תחומיות של MITI. MRic הוא חבר בתשתית הלאומית צרפת-הדמיה ביולוגית הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04).

1. הפקת סכרינה לטיסימה גמטופיטים
<ol><li>לאסוף ספורופיטים בוגרים של S. latissima מהטבע כפי שתואר קודם לכן20,21. ודא שהספורופיטים שנבחרו נטולי אפיפיטים (אורגניזמים קטנים הנראים על פני השטח של הלהב) או טפילים פנימיים (המצויים באזורים הלבנים או בכתמים...

<ol>
	<li>Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+studies+of+the+role+of+the+Drosophila+oocyte+nucleus+in+pattern+formation.">Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.</a> Science. 254 (5029), 290-293 (1991).</li><li>Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+to+probe+the+epithelial+mechanics+in+drosophila.">Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila.</a> Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).</li><li>Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+laser+ablation+with+tunable+lesion+size+reveals+multiple+origins+of+seizure-like+convulsions+in+Caenorhabditis+elegans.">Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).</li><li>Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+femtosecond-laser+ablation+of+Xenopus+laevis+melanocytes+for+studies+of+cell+migration,+wound+repair,+and+developmental+processes.">Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).</li><li>Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+and+laser+ablation+analysis+of+leaf+positioning+and+dorsoventral+patterning+in+tomato.">Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato.</a> Development. 132 (1), 15-26 (2005).</li><li>Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+in+Arabidopsis+roots:+a+tool+to+study+cell-to-cell+communication.+Cellular+integration+of+signalling+pathways+in+plant+development.">Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development.</a> Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).</li><li>Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+by+the+cell+wall+in+early+fucus+development.">Cell fate determination by the cell wall in early fucus development.</a> Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).</li><li>Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+dependent+control+of+cell+fate+in+the+Fucus+embryo:+role+of+intercellular+communication.">Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication.</a> Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).</li><li>Bringloe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+the+brown+algae.">Phylogeny and evolution of the brown algae.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).</li><li>Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Hand&#229;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+of+the+brown+seaweed,+saccharina+latissima:+a+review.">Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review.</a> Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).</li><li>Zhang, X., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techno-economic+and+environmental+assessment+of+novel+biorefinery+designs+for+sequential+extraction+of+high-value+biomolecules+from+brown+macroalgae+Laminaria+digitata,+Fucus+vesiculosus,+and+Saccharina+latissima.">Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima.</a> Algal Research. 60, 102499 (2021).</li><li>Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+gametophytes+of+some+japanese+species+of+laminariales.">On the gametophytes of some japanese species of laminariales.</a> Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).</li><li>Fritsch, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).</li><li>Bartsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genus+Laminaria+sensu+lato+:+recent+insights+and+developments.">The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments.</a> European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).</li><li>Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Brown+algae:+ectocarpus+and+saccharina+as+experimental+models+for+developmental+biology.">Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. , 485 (2021).</li><li>Drew, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reproduction+and+early+development+of+laminaria+digitata+and+laminaria+saccharina.">The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina.</a> Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).</li><li>Yendo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+costaria,+undaria,+and+laminaria.">The development of costaria, undaria, and laminaria.</a> Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).</li><li>Forbord, S., Steinhovden, K., R&#248;d, K., Hand&#229;, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+protocol+for+Saccharina+latissima.">Cultivation protocol for Saccharina latissima.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).</li><li>Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+clonal+stock+cultures+and+hybridization+of+kelps.">Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps.</a> Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).</li><li>Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+zygotes+and+embryos+of+the+kelp+saccharina+latissima+for+cell+biology+approaches.">Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches.</a> Bio-protocol. 101, 4132 (2021).</li><li>L&#252;ning, K., Dring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+induced+by+blue+light+in+female+gametophytes+of+Laminaria+saccharina.">Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina.</a> Planta. 104 (3), 252-256 (1972).</li><li>de Medeiros, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+manipulation+with+ultrashort+infrared+laser+pulses+in+light-sheet+microscopy.">Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).</li><li>Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tension+at+cell-cell+junctions+using+two-photon+laser+ablation.">Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation.</a> Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).</li><li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+(Phaeophyceae).">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li><li>Rabill&#233;, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brown+algal+mode+of+tip+growth:+Keeping+stress+under+control.">The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control.</a> PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).</li></ol>

אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומרחבית ברמת דיוק גבוהה. עם זאת, יעילותו עלולה להיפגע על ידי אי הנגישות של תאי המטרה; לדוגמה, כל התאים הם של עובר תלת מימדי. פרוטוקול זה פותח על העובר של אצה Saccharina latissima, אשר מפתחת למינה חד שכבתית שבה ניתן להבחין בקלות בין כל התאים ולהשמיד ?...

אבלציה בלייזר משמשת כבר עשרות שנים לחקר התפתחות העוברים. הקרנת תאי עובר באמצעות קרן לייזר מאפשרת לעקוב אחר הפוטנציאל הרגנרטיבי והשינוי של שושלת התאים במהלך העובר ולחקור את ההשפעה של אבלציה ממוקדת על חלוקת התא ועל גורל התא. אורגניזמי המודל המשמשים בשיטות אבלציה בלייזר הם בדרך כלל בעלי חיים, כגון חרקים 1,2, נמטודות 3,4, בעלי חוליות 5,6, ולעיתים צמחים 7,8. בנוסף, נעשה שימוש בגישת מיקרו-אבלציה בלייזר על האצה החומה פוקוס בשנים 1994 ו-1998 כדי להדגים את תפקידו של דופן התא בפוטו-פולריזציה של העובר המוקדם 9,10.
אצות חומות שייכות לקבוצה Stramenopiles, שהתפצלה בשורש העץ האאוקריוטי לפני 1.6 מיליארד שנה. כתוצאה מכך, הם אינם תלויים מבחינה פילוגנטית באורגניזמים רב-תאיים אחרים, כגון בעלי חיים וצמחים11. Saccharina latissima שייך לסדר Laminariales, הידוע יותר בשם kelps, והם בין האורגניזמים הגדולים ביותר על פני כדור הארץ, המגיעים לגדלים של מעל 30 מ '. Saccharina sp. היא אצה גדולה המשמשת ליישומים רבים כגון מזון והזנה, והפוליסכרידים שלה מופקים לשימוש בתעשיות החקלאיות, הפרמקולוגיות והקוסמטיות ברחבי העולם12, 13. גידולו, בעיקר באסיה ולאחרונה באירופה, דורש הכנת עוברים במדגרות לפני שחרור צעירים בים הפתוח. כמו כל הקלפים, יש לו מחזור חיים דו-פאזי המורכב משלב גמטופיטי מיקרוסקופי, שבמהלכו גמטופיט הפלואידי גדל ומייצר גמטות להפריה, ופאזה מקרוסקופית דיפלואידית, שבה מתפתח להב מישורי גדול מתוך ההחזקה שלו המחובר לקרקעית הים או לסלעים. הספורופיט משחרר נבגים הפלואידים בבגרותם, ובכך משלים את מחזור החיים 14,15,16.
S. latissima מציג כמה תכונות מורפולוגיות מעניינות17. העובר שלו מתפתח כסדין מישורי חד-שכבתי 15,18,19 לפני שהוא רוכש מבנה רב שכבתי במקביל להופעתם של סוגי רקמות שונים. בנוסף, Laminariales היא אחת הטקסות היחידות של אצות חומות שהעוברים שלהן נשארים מחוברים לרקמה הגמטופיטית האימהית שלהן (Desmarestiales ו-Sporochnales עושים גםהם 15). תכונה זו מציעה את ההזדמנות לחקור את תפקידה של הרקמה האימהית בתהליך התפתחותי זה ולהשוות את מנגנוני הבקרה האימהיים באצות חומות עם אלה בבעלי חיים ובצמחים.
מאמר זה מציג את הפרוטוקול המלא הראשון לאבלציה בלייזר בעובר אצות מוקדם. פרוטוקול זה, הכולל טכניקה של UV ns-pulsed, גורם להרס ספציפי של תאי עובר בודדים כדי לחקור את תפקידם במהלך יצירת עוברים. ההליך מציע גישה אמינה לחקר אינטראקציות בין תאים וגורל התאים במהלך עוברי בלמינריאלס.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 mm glass bottom petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved sea water</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Collected offshore near the Astan buoy (48&#176;44.934 N 003&#176;57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>MED 2</td>
			<td>83.3951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning / Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture cabinets</td>
			<td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td>
			<td></td>
			<td>Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 Zeiss confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359947</td>
			<td>Blue polypropylene (autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Provasoli supplement</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount</td>
			<td>PDSS 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SysCon software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser-driver software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN software</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted laser ablation in the embryo of saccharina latissima

ב Saccharina latissima, העובר מתפתח כמו יריעת תא חד שכבתית הנקראת למינה או הלהב. כל תא עובר קל לצפייה, ניתן להבחין בקלות בין שכניו לבין שכניו, וניתן לפגוע בו בנפרד. במשך עשרות שנים, אבלציה בלייזר שימשה לחקר התפתחות העוברים. כאן פותח פרוטוקול לאבלציה בלייזר ספציפי לתא עבור עוברים מוקדמים של האצה החומה S. latissima. העבודה המוצגת כוללת: (1) הכנת עוברי סכרינה , עם תיאור הפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי תרבית, (2) הגדרות אבלציה בלייזר, ו-(3) ניטור הצמיחה שלאחר מכן של העובר המוקרן באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן. בנוסף, מסופקים פרטים על התנאים האופטימליים להעברת העוברים מפלטפורמת ההדמיה בחזרה למעבדה, מה שיכול להשפיע עמוקות על התפתחות העוברים הבאים. אצות השייכות לסדר למינריאלס מציגות תבניות עובריות הדומות לסכרינה; כך ניתן להעביר פרוטוקול זה בקלות למינים אחרים בטקסון זה.

גמטופיטים של S. latissima גודלו, וגמטוגנזה הושרה כדי לייצר זיגוטים ועוברים. 12 ימים לאחר אינדוקציה של גימטוגנזה, העוברים עברו אבלציה בלייזר. כאן, הניסוי נועד להעריך את תפקידם של תאים ספציפיים בהתפתחות הכוללת של עוברי S. latissima . התא האפיקלי ביותר, התא הבסיסי ביותר, והתאים החציוניים היו ממו...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima at JoVE.com

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

השמדת תאים ספציפיים בעובר היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות תאיות המעורבות בגורל התא. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לאבלציה בלייזר של תאים ממוקדים בעובר המוקדם של האצה החומה Saccharina latissima.

אבלציה ממוקדת לייזר בעובר של סכרינה לטיסימה

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

פרוטוקול זה הוא פרוטוקול האבלציה המלא הראשון בלייזר על עובר אצות ים מוקדם. ההליך מציע גישה אמינה לחקר גורל התאים והאינטראקציה שלהם במהלך יצירת עוברים באצות חומות. אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומיוחדת עם רמה גבוהה של דיוק ורקמות על התאים.גישה זו היא שיטה מבטיחה לחקר גורלם של תאים ואינטראקציה בעובר המוקדם של אצות חומות. ניתן ליישם אותו על מערכות אצות אחרות עם שינויים מעטים. התחל על ידי הדמיה של כל צלחת פטרי כדי לאתר את העוברים לבחירה במהלך שלב האבלציה ולעקוב אחר ההתפתחות הבאה של העוברים שנבחרו.התחל את סריקת האריחים. רשום את המיקום של ארבע הנקודות הקרדינליות של צלחת פטרי. הזן את הפרמטרים כפי שהוגדרו בכתב היד של הטקסט וקבל תמונות מועברות או פלואורסצנטיות של כל צלחת פטרי ברזולוציה נמוכה.שמור את תמונת סריקת האריחים והשאר אותה פתוחה בחלון התוכנה לרכישת תמונה. שנה את המטרה מבלי להסיר את צלחת הפטרי. מצא עוברים בעלי עניין בסריקה.כדי לכייל את הלייזר, פתח את דרייבר הלייזר ואת חבילת התוכנה לרכישת תמונה. לאחר מכן אתחל את נתיב הלייזר. סנכרן את שתי חבילות התוכנה על-ידי לחיצה על התחלת הרכישה בחבילת התוכנה של מנהל ההתקן בלייזר.הגדר את הפרמטרים עבור אבלציה בלייזר ולחץ על בשידור חי. בחרו אזור ריק בצלחת והורידו את מפלס הבמה ל-20 מיקרומטרים מתחת לפני השטח העליונים של צלחת הפטרי כדי להתמקד בתחתית הכוס. כדי למצוא אזור עניין על ידי לחיצה על כפתור בחר AOI ולחיצה על קצות התמונה בחבילת התוכנה לנהג לייזר UV.לחץ על כיול התחל ובחר כיול ידני כדי להגדיר את מסלולי לייזר האבלציה ולייזר ההדמיה. ודאו שכל התריסים פתוחים. בחר עוצמת לייזר גבוהה מספיק כדי לראות נקודה שחורה במרכז התמונה החיה המתאימה לחור בהחלקת כיסוי הזכוכית.לחץ על הנקודה השחורה המרכזית עם סמן העכבר ובחר 18 נקודות נוספות המוצעות על ידי התוכנה כדי להשלים את הליך היישור. לחץ על מצב הלחיצה והאש. בדקו את הכיול באותה החלקת כיסוי ולחצו על שכבת הזכוכית שבה נראית פגיעת הלייזר.בחר עובר בעל עניין בסריקת האריחים והזז את הבמה על ידי לחיצה עליו. התחל את סדרת הזמן. בדוק את הפרמטרים של קיטועי הזמן בשידור חי והתאם במידת הצורך.התחל הקלטה של קיטועי זמן בתוכנת רכישת התמונה במהירות המרבית. התאם את הזום כדי להתמקד באזור העניין ולדמיין את העובר כולו. כדי לעקוב אחר העובר במהלך הקלטת אבלציה, לחץ על הכפתור, לרכוש את התמונה האחרונה.הגדר את הפרמטרים ל-45% שידור לייזר המתאים למקסימום של 40 מיקרו-וואט ומשך זמן דופק של אלפית השנייה. החל את ההקרנה המזיקה על תאי העובר המעניינים על ידי שימוש בתוכנת הלחיצה והאש של מנהל ההתקן בלייזר. תחת 688 ננומטרים, עקוב אחר פליטת הכלורופלסטים האוטו-פלואורסצנטיים מהציטופלסמה.אם תוכן התא נשאר בתא, השתמש שוב בפונקציית הלחיצה והאש כדי להגדיל את גודל הפרצה בתא. חזור על תהליך זה עד שרוב תוכן התא ישוחרר, תוך שמירה על מספר הצילומים למינימום. יש להפסיק את רישום חלוף הזמן לאחר שהעובר התייצב ולא ניתן לזהות תנועה בין-תאית נוספת.עדכן את ההערה בתמונת סריקת האריחים, החלף את סריקת האריחים הקיימת ושמור את התמונה. קבע את שיעור ההישרדות על ידי ניטור מספר העוברים המתפתחים לאחר אבלציה בלייזר והשווה אותם לאלה שמתים. קבעו את עיכוב הגדילה על ידי מדידת אורך העוברים הזרומים בלייזר מדי יום והשוואתו לעוברים שלמים.מצא את הנזק הסמוך על ידי ניטור התגובה של תאים הסמוכים לתאים האבלים. תאים ממוקדים בעלי עניין היו התא האפיקלי ביותר, התא הבסיסי ביותר, והתאים החציוניים. לאחר סריקת אריחים של כל צלחת הפטרי, זוהה עובר בעל עניין כמועמד מתאים לירי בלייזר.התא שחרר את תכולתו כאשר נורה עם קרן לייזר UV דופק בהספק של 45%, בעוד שהתא הסמוך לתאים המוקרנים התרחב לתוך החלל הבין-תאי. מיקום העוברים המוקרנים נרשם כל 24 שעות במשך 10 ימים. רוב העוברים המוקרנים המשיכו להתפתח אך הראו שינוי בגדילה.לעומת זאת, עוברים שנבדקו עם פרמטרים אחרים של לייזר הראו במהירות סימנים של עקה חמורה כמו הלבנת תאים, דהייה או שינויי צורה. כמעט כל העוברים שנורו בדרך זו מתו תוך חמישה ימים לאחר הניסוי. אין לשנות פרמטרים מסוימים, כגון תבנית תמונה או זום לאחר הכיול.ניטור במהלך ואחרי אבלציה בלייזר נדרש כדי לקבל תובנה לגבי מה שקרה. אבלציה בלייזר סוללת את הדרך לתגליות חדשות במחקר התפתחותי של אצות חומות ולהבנה מעמיקה יותר של אינטראקציות של מטבוליטים או רכיבים שונים של התאים שלהן.

targeted-laser-ablation-in-the-embryo-of-saccharina-latissima

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

האפקטיביות של פירוק אוויר בדגים Salmonid שני, פורל הקשת (Oncorhynchus Mykiss) ופורל חום (Salmo Trutta מורפיום fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...