Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

يشكر المؤلفون Vector Core في جامعة نورث كارولينا على توفير ناقلات scAAV8-GFP المستخدمة في هذه الدراسة ، و CGIBD Coistology Core ، ومختبر الدكتور Brian C. Gilger لمساعدتهم في جوانب التقييم السريري لهذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه المتميزة في Pfizer-NC Biotech وجائزة التطوير الوظيفي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي ومؤسسة التليف الكيسي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو مؤسسة التليف الكيسي.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. استخدام نواقل AAV هو خطر بيولوجي من المستوى 1 للسلامة البيولوجية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية عند التعام?...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

يحمل العلاج الجيني بوساطة AAV إمكانات كبيرة لعلاج أمراض العين. يعتمد العلاج الجيني العيني الحالي على طريقين رئيسيين للإدارة المحلية ، الحقن داخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية. لسوء الحظ ، كلا الطريقين غازيان ويمكن أن يسببان مضاعفات خطيرة ، بما في ذلك انفصال الشبكية وتشكيل إعتام عدسة العين وا?...

تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة. في عام 2015، كان ما يقدر بنحو 36 مليون شخص يعانون من العمى القانوني في جميع أنحاء العالم، ويعاني أكثر من مليار شخص من مستوى معين على الأقل من ضعف البصر، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى توسيع نطاق جهود التخفيف على جميع المستويات1. تشمل الطرق الرئيسية لتوصيل أدوية العين كلا من الإدارة الموضعية والمحلية ، مثل قطرات العين أو الحقن تحت الملتحمة (SCJ) ، والحقن داخل الكاميرا ، داخل الجسم الزجاجي ، وتحت الشبكية. على الرغم من أن العلاج الموضعي غير الباضع هو طريقة التوصيل الأكثر شيوعا لأدوية العيون ويستخدم على نطاق واسع للعديد من اضطرابات الجزء الأمامي ، فإن وجود حواجز تشريحية للقرنية يمثل تحديا للتوافر البيولوجي والتوزيع الحيوي وفعالية المواد المدارة موضعيا ، مما يشير إلى أنه قد لا يكون أفضل طريق علاج مرشح للعديد من أمراض العين الداخلية. من المرجح أن يكون الحقن الموضعي في حجرة العين المحددة المتأثرة بالمرض نهجا أكثر فعالية واستهدافالتوصيل الدواء 2. ومع ذلك ، فإن الآثار الضارة الناتجة عن الحقن المتكررة يمكن أن تعقد استراتيجيات الإدارة. من الناحية المثالية ، يجب أن يحافظ العلاج على فعالية علاجية طويلة الأجل بعد إدارة واحدة. وبالتالي ، يعد العلاج الجيني خيارا واعدا لتقليل عدد الحقن المطلوبة وتوفير تعبير جيني محوري مستدام لعلاج مرض العين 3,4.
تتوفر العديد من النواقل الفيروسية وغير الفيروسية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، فإن ناقلات AAV ذات أهمية كبيرة بسبب ملف تعريف السلامة الممتاز. AAV هو فيروس DNA صغير ، تقطعت به السبل ، غير مغلف تم اكتشافه في البداية كملوث لإعداد الفيروس الغدي في عام 1965 بواسطة Atchison et al.5,6 تم تصميم AAV لاحقا كناقل فيروسي فعال لتوصيل الجينات في 1980s وأصبح ناقل العلاج الجيني المفضل للعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات العين ، على مدى العقود القليلة الماضية. أبرزها هو أول دواء للعلاج الجيني متاح تجاريا ، voretigene neparvovec ، والذي تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج داء ليبر الخلقي ، وهو مرض نادر في العين الخلفية. على الرغم من أن voretigene neparvovec قد تغلب بنجاح على الحواجز التي تحول دون التطوير السريري ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات أمام تسويق علاجات جينية إضافية للعين. على سبيل المثال ، يتم إعطاء voretigene neparvovec للمرضى الذين يحتفظون بخلايا شبكية قابلة للحياة عن طريق الحقن تحت الشبكية. وبالتالي ، فإن المرضى الذين يعانون من أشكال أكثر تقدما من المرض والذين يفتقرون إلى خلايا شبكية قابلة للحياة غير مؤهلين للعلاج ، لأنه لن يوفر أي فائدة سريرية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مضاعفات معروفة مرتبطة بإجراء الحقن تحت الشبكية ، بما في ذلك التهاب العين ، إعتام عدسة العين ، تمزق الشبكية ، اعتلال البقعة ، والألم 7,8. تشمل المخاوف الأخرى المتعلقة بهذا الإجراء إمكانية حدوث نزيف ، وانفصال الشبكية ، والتهاب باطن المقلة ، وإلغاء حالة امتياز المناعة العينية من خلال تدمير أنسجة العين9،10،11،12. وبالتالي ، أصبحت الجهود المبذولة لاستكشاف طرق توصيل الجينات الأقل توغلا مثل حقن SCJ ذات أهمية متزايدة13،14،15،16،17.
الملتحمة عبارة عن غشاء رقيق يحتوي على 3-5 طبقات من الخلايا ويربط العين الأمامية بالجفن الداخلي. تستخدم حقن SCJ سريريا لتوصيل أدوية العيون إلى كل من الأجزاء الأمامية و / أو الخلفية من العين لعلاج أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والزرق ، والتهاب الشبكية ، والتهاب القزحية الخلفي18,19. إنها بسيطة نسبيا في الأداء ، وتستخدم بشكل روتيني لتوصيل أدوية العيون في العيادات الخارجية20 ، غير مؤلمة إلى حد ما ، ولا تضر بامتياز المناعة العينية ، وتسمح للأدوية المعطاة بالانتشار عبر منطقة كبيرة حول الحجاج تشمل العصب البصري. وبالتالي ، فإن حقن SCJ هي طريقة جذابة للإعطاء لتطبيقات العلاج الجيني AAV. تم سابقا وصف الأنماط المصلية الطبيعية AAV التي يتم إعطاؤها عن طريق حقن SCJ في الفئران من أجل السلامة وكفاءة النقل ومناعة المصل والتوزيع الحيوي وخصوصية الأنسجة13،16،21. أظهرت هذه البيانات أن توصيل الجينات إلى أنسجة العين الفردية عن طريق إدارة SCJ هو احتمال رسمي.
تصف هذه الورقة بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكيف لحقن SCJ لتقديم متجهات AAV في نموذج ماوس. لضمان استنساخ هذا النهج ، تم وصف نظام حقن يتكون من مجهر مجسم ، ومضخة حقنة قابلة للبرمجة بالتسريب / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) ، وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغلق مقترنة بإبر الحقن المجهري. هذا النظام قابل للتكيف مع طرق الإدارة داخل العين الأخرى مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم استخدام صبغة الفلوريسئين للسماح بتصور موقع حقن AAV. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. أخيرا ، ستتم مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة التي تعد أهدافا جذابة لتوصيل الأدوية المحلية نظرا لسهولة الوصول إليها نسبيا عبر طرق إدارة متعددة. توفر الحقن تحت الملتحمة (SCJ) مزايا مقارنة بطرق الإدارة داخل العين الأخرى لأنها بسيطة وآمنة وعادة ما يتم إجراؤها في العيادات الخارجية. عادة ما تتطلب حقن SCJ في الحيوانات الصغيرة مساعدة مجهر التشغيل بسبب حجم العين. أظهرت الأعمال السابقة أن حقن SCJ لأنماط مصلية محددة مرتبطة بالفيروس الغدي (AAV) هو استراتيجية صالحة لتوصيل الجينات للنقل المستهدف لسطح العين وعضلة العين والقرنية والعصب البصري ، مما يوفر نهجا محتملا لعلاج العديد من أمراض العين.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن SCJ في نموذج الماوس باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة قابلة للبرمجة / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغاز إلى جانب إبر الحقن المجهري. نظام الحقن قابل للتكيف أيضا مع طرق الإدارة الأخرى داخل العين مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. على الرغم من وصف توصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لدراسات العلاج الجيني للعين ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول هنا لمجموعة متنوعة من حلول العيون في نماذج الحيوانات الصغيرة. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضا مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.

يظهر المحلول المحقون في الفضاء تحت الملتحمة على شكل فقاعة اعتمادا على حجم الحقن. في هذه التجربة ، تم حقن 7 ميكرولتر من AAV (7 × 109 جينومات فيروسية (vg) / عين) مختلطة مع الفلوريسئين بتركيز نهائي قدره 0.1٪ بإبرة 36 G تحت مجهر مجسم ، وتم الحفاظ على سرعة الحقن / الضغط ثابتا باستخدام مضخة ح...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

في هذه المخطوطة، يتم توضيح الحقن تحت الملتحمة كطريقة صالحة لتوصيل النواقل لأنسجة العين في الفئران باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة تسريب/سحب وحقنة قابلة للإزالة محكمة الإغلاق مقترنة بإبر الحقن المجهري. نظام الحقن هذا قابل للتكيف أيضا مع طرق إدارة العين الأخرى.

الإعطاء تحت الملتحمة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة في نماذج الحيوانات الصغيرة

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوصيل العلاج الجيني إلى أنسجة العين المتعددة بطريقة آمنة وسهلة وفعالة. كما أنه قابل للتكيف مع الحقن داخل اللحمة وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. استخدام طريق الحقن تحت الملتحمة هو الحد الأدنى الغازية.إنه يشكل مخاطر أقل ويبشر بتسليم AV لعلاج أمراض العين المتعددة. مع وجود أكثر من 1 مليار شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من ضعف البصر ، فإن استخدام طريقة آمنة وسهلة لتوصيل الأدوية يوفر قابلية تطبيق واسعة لعلاج العديد من الأسباب المختلفة للعمى. تعتبر طرق توصيل الجينات الموصوفة في هذا البروتوكول ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يطورون استراتيجيات التدخل المحتملة وأطباء العيون الممارسين ، الذين سيقدمون هذه الأدوية في النهاية للمرضى.من المحتمل أن يكون التحدي الأكبر الذي يواجه الشخص الذي يقوم بتنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة هو إدخال الإبرة في مفهوم مساحة الملتحمة. للبدء ، قم بتجميع نظام الحقن عن طريق وضع مجهر ستيريو ومضخة حقنة في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، قم بقطع أنبوب البولي إيثيلين بطول حوالي 50 سم.أدخل نهاية إبرة قياس 36 في أحد طرفي الأنبوب. ثم املأ حقنة سعة 3 ملليلتر يمكن التخلص منها بالماء المعقم وأدخلها في جانب الأنبوب المقابل للإبرة. اغسل الأنبوب ثلاث مرات ، بالتناوب بين الماء المعقم والكحول بنسبة 70٪ لتطهير الأنبوب والتأكد من عدم وجود تسرب أو انسداد أو تلف في جميع أنحاء الأنبوب.باستخدام حقنة 3 ملليلتر التي تستخدم لمرة واحدة ، املأ الأنبوب بالماء المعقم واترك الأنبوب متصلا بالمحقنة التي تستخدم لمرة واحدة. ثم ضع قطعة من البارافوم على سطح خزانة السلامة الحيوية ، وأضف بركة من الماء المعقم إليها. اغمر جزء الأنبوب المتصل بالإبرة في بركة الماء المعقم.بعد ذلك ، اسحب المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة من فتحة الأنبوب لمنع أي هواء من دخول نظام الأنابيب عند إزالة المحقنة. ثم املأ حقنة هاملتون سعة 10 ميكرولتر بالماء المعقم. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة حقنة هاملتون بالطرف المفتوح للأنبوب عن طريق غمر طرف إبرة حقنة هاملتون في بركة الماء المعقم على فيلم الفقرة.اضغط مع الاستمرار على الزر العكسي السريع على شاشة المضخة لتحريك كتل الدفع إلى الطول التقريبي للمحقنة. بعد ذلك ، قم بفك مقابض تثبيت الدعامة لفك أقواس التثبيت الموجودة على الدافع وكتل حامل المحقنة. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة هاملتون على كتلة حامل المحقنة وقم بتأمين المحقنة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.لضبط المعلمات في شاشة إعداد المضخة ، اضغط على زر "القوة" واضبط مستوى القوة على 30٪ ثم اقبل التغييرات للعودة إلى شاشة الإعداد. اضغط على زر البدء السريع ، وحدد الطريقة ، ثم حدد خيار Infuse Only. بالنسبة لخيار المحقنة ، حدد Hamilton 1700 ، ثم انقر فوق زجاج"وحدد 10 ميكرولتر.في وقت لاحق ، حدد معدل التسريب وحجم الحقن. أخرج الماء من حقنة هاملتون مع ترك الأنبوب وإبرة الحقن مليئة بالماء عن طريق الضغط على زر Infuse. بعد ذلك ، اسحب الفيروس عن طريق وضع إبرة الحقن في حصص من مخزون الفيروس.ثم اسحب حقنة هاملتون قليلا عن طريق الضغط على الزر العكسي لإدخال فقاعة هواء صغيرة في الأنبوب. بعد تخدير الحيوان ، أمسك الملتحمة بالملقط. ثم أدخل الإبرة في الملتحمة حتى يتم تغطية شطبة بالكامل بواسطة غشاء الملتحمة ، ووضع الإبرة على الكرة الأرضية.في نفس الوقت ، ابدأ الحقن بالضغط على زر "ابدأ" باستخدام مفتاح القدم. لفحص توزيع ناقل AAV ، تم تلطيخ الأنسجة العينية والأنسجة المحيطة بالهيماتوكسيلين واليوزين. أظهرت المقاطع السهمية التمثيلية أن تشتت الحبر الهندي حدث بشكل رئيسي بجوار العضلات خارج العين في السطح الخارجي للصلبة في الأنسجة الضامة الرخوة حول العين.لتأكيد نقل AAV 8 الذاتي في ثمانية أسابيع بعد الحقن ، تم فحص وفرة البروتين الفلوري الأخضر في المقاطع العرضية عن طريق تلطيخ التألق المناعي. كشفت النتائج أن ناقلات AAV 8 نقلت بكفاءة عضلات العين الخلفية إلى العين والقرنية. لتحليل التوزيع الحيوي للناقل ، تم فحص أرقام نسخ جينوم النواقل ومقصورات العين المميزة في الأعضاء الأخرى ، بما في ذلك الكبد والقلب ، عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي باستخدام البادئات والمجسات الخاصة بجين التحوير.تم تأكيد التعبير عن جين التحوير من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي ، والذي اقترح أن الحقن تحت الملتحمة ل AAV 8 يؤدي إلى تعبير الجينات المحورة في الجفن والملتحمة والقرنية والعصب البصري. ستكون فقاعة الهواء بمثابة حاجز بين الماء في الأنبوب والدواء العلاجي. تسمح هذه التقنية للباحثين الآخرين باستكشاف استخدام طريق الإعطاء تحت الملتحمة لكل من محاليل العيون والعلاجات الجينية العينية لأمراض متعددة.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

بروتوكول لونغ ارتفاع الحرارة المدة الجسم الجامع في الفئران

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

نظام القلب العامل المعزولة لنماذج حيوانية كبيرة

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية للماوس عنق الرحم الغدد الليمفاوية

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

في فيفو تقييم التنمية دشبذ الكسر أثناء التئام العظام في الفئران باستخدام جهاز الصدمة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لعظم الفخذ الماوس

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

أخذ عينات الدم المستمر في التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الحيواني الصغير/التصوير المقطعي المحوسب يمكّن من قياس وظيفة الإدخال الشرياني

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...