Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for at levere scAAV8-GFP-vektorerne, der blev brugt i denne undersøgelse, CGIBD Histology Core og laboratoriet hos Dr. Brian C. Gilger for deres hjælp med de kliniske vurderingsaspekter af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereudviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Carolina i Chapel Hill. Brugen af AAV-vektorer er en biosikkerhedsniveau 1 biohazard risiko. Brug korrekt personligt beskyttelsesudstyr, herunder en laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller, når du håndterer AAV. Til eksperimentet beskrevet heri blev der anvendt en rekombinant AAV-vektor pakket med serotype 8-kapsidet og kodning af en generisk allestedsnærværende cytomegalovi...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV-medieret genterapi rummer et stort potentiale for behandling af øjensygdomme. Den nuværende okulære genterapi er afhængig af to store lokale administrationsveje, intravitreale og subretinale injektioner. Desværre er begge ruter invasive og kan forårsage alvorlige komplikationer, herunder nethindeløsning, dannelse af grå stær og endophthalmitis. Således er undersøgelsen af relativt mindre invasive ruter, såsom SCJ-injektion, af stor interesse.
Selvom denne teknik er relativt lig...

Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af både genetiske og erhvervede lidelser. I 2015 var anslået 36 millioner mennesker juridisk blinde på verdensplan, og over 1 milliard mennesker lider af mindst en vis grad af synshandicap, hvilket understreger behovet for at opskalere lindringsindsatsen på alle niveauer1. De vigtigste metoder til levering af okulær medicin omfatter både topisk og lokal administration, såsom øjendråber eller subkonjunktivale (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner. Selvom ikke-invasiv topisk terapi er den mest almindelige leveringsmetode for oftalmiske lægemidler og i vid udstrækning anvendes til mange forreste segmentforstyrrelser, udgør tilstedeværelsen af hornhinde anatomiske barrierer en udfordring for biotilgængeligheden, biodistributionen og effektiviteten af topisk administrerede stoffer, hvilket tyder på, at det måske ikke er den bedste kandidatbehandlingsrute for mange sygdomme i det indre øje. Lokal injektion i det specifikke okulære rum, der er ramt af sygdommen, vil sandsynligvis være en mere effektiv og målrettet lægemiddelafgivelsesmetode2. Imidlertid kan bivirkninger som følge af gentagne injektioner komplicere administrationsstrategier. Ideelt set bør en terapi opretholde langsigtet terapeutisk effekt efter en enkelt administration. Genterapi er således en lovende mulighed for at minimere antallet af nødvendige injektioner og tilvejebringe vedvarende transgenekspression til behandling af okulær sygdom 3,4.
Talrige virale og ikke-virale vektorer er tilgængelige til genterapi; AAV-vektorer er dog af stor interesse på grund af deres fremragende sikkerhedsprofil. AAV er en lille, enkeltstrenget, ikke-indhyllet DNA-virus, der oprindeligt blev opdaget som en forurening af et adenoviruspræparat i 1965 af Atchison et al.5,6 AAV blev efterfølgende konstrueret som en effektiv viral vektor til genlevering i 1980'erne og er blevet den valgte genterapivektor for mange sygdomme, herunder okulære lidelser, i løbet af de sidste par årtier. Den mest bemærkelsesværdige af disse er det første kommercielt tilgængelige genterapilægemiddel, voretigene neparvovec, som blev godkendt af USA's Food and Drug Administration til behandling af Lebers medfødte amaurose, en sjælden bageste øjensygdom. Selvom voretigene neparvovec med succes har overvundet barrierer for klinisk udvikling, er der stadig udfordringer for kommercialisering af yderligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til patienter, der bevarer levedygtige retinale celler via subretinal injektion. Således er patienter med mere avancerede former for sygdommen, der mangler levedygtige retinale celler, ikke berettiget til behandling, da det ikke ville give nogen klinisk fordel. Derudover blev der observeret kendte komplikationer forbundet med subretinal injektionsproceduren, herunder øjenbetændelse, grå stær, retinal rive, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer i forbindelse med denne procedure omfatter muligheden for blødning, retinal løsrivelse, endophthalmitis og tilbagekaldelse af den okulære immun privilegerede status gennem øjenvævsdestruktion 9,10,11,12. Således er bestræbelser på at udforske mindre invasive genleveringsruter såsom SCJ-injektion blevet stadig vigtigere 13,14,15,16,17.
Bindehinden er en tynd membran, der indeholder 3-5 lag celler og forbinder det forreste øje med det indre øjenlåg. SCJ-injektioner anvendes klinisk til oftalmisk lægemiddelafgivelse til både de forreste og / eller bageste segmenter af øjet til behandling af okulære sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration, glaukom, retinitis og posterior uveitis18,19. De er relativt enkle at udføre, anvendes rutinemæssigt til oftalmisk lægemiddelafgivelse i en ambulant indstilling20, noget smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium og tillader administrerede lægemidler at sprede sig gennem en stor periorbital region, der omfatter synsnerven. Derfor er SCJ-injektioner en attraktiv administrationsvej for AAV-genterapiapplikationer. Naturlige AAV-serotyper administreret via SCJ-injektion i mus har tidligere været karakteriseret for sikkerhed, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution og vævsspecificitet13,16,21. Disse data viste, at genlevering til individuelle okulære væv via SCJ-administration er en formel mulighed.
Dette papir beskriver en enkel og tilpasningsdygtig protokol til SCJ-injektion til at levere AAV-vektorer i en musemodel. For at sikre, at denne fremgangsmåde kan reproduceres, beskrives et injektionssystem bestående af et stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som muliggør ensartet og præcis injektionshastighed og -tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette system kan tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Derudover bruges et fluoresceinfarvestof ofte til at muliggøre visualisering af AAV-injektionsstedet. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Endelig vil fælles valideringsteknikker til bekræftelse af AAV-levering til det ønskede væv kort blive diskuteret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af arvelige genetiske og erhvervede lidelser, der er tiltalende mål for lokal lægemiddellevering på grund af deres relative lette tilgængelighed via flere administrationsveje. Subkonjunktivale (SCJ) injektioner giver fordele i forhold til andre intraokulære administrationsveje, da de er enkle, sikre og normalt udføres i en ambulant indstilling. SCJ-injektioner i små dyr kræver normalt hjælp fra et operativt mikroskop på grund af øjets størrelse. Tidligere arbejde har vist, at SCJ-injektion af specifikke adeno-associerede virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi til målrettet transduktion af den okulære overflade, øjenmuskel, hornhinde og synsnerve, hvilket giver en potentiel tilgang til behandling af mange okulære sygdomme.
Heri præsenteres en detaljeret protokol for SCJ-injektioner i en musemodel ved hjælp af et injektionssystem bestående af en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som giver mulighed for ensartet og præcis injektionshastighed og tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Injektionssystemet kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Selvom levering af adeno-associerede virale vektorer til okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen heri også tilpasses til en række oftalmiske opløsninger i smådyrsmodeller. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Derudover vil almindelige valideringsteknikker til AAV-leveringsbekræftelse til det ønskede væv også blive kort diskuteret.

Opløsning injiceret i det subkonjunktivale rum præsenterer som en bleb afhængigt af injektionsvolumenet. I dette forsøg blev 7 μL AAV (7 × 109 virale genomer (vg)/øje) blandet med fluorescein i en slutkoncentration på 0,1% injiceret med en 36 G nål under et stereomikroskop, og injektionshastigheden / trykket blev holdt konstant ved hjælp af en programmerbar sprøjtepumpe ved 1 μL / s. En bleb kan vises ved injektion (pil). En mikroskopisk visning af AAV-vektoradministration til m...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

I dette manuskript demonstreres subkonjunktival injektion som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært væv hos mus ved hjælp af et injektionssystem bestående af en infusions- / tilbagetrækningssprøjtepumpe og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette injektionssystem kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje.

Subkonjunktival administration af adeno-associerede virusvektorer i smådyrsmodeller

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Denne protokol tilbyder en metode til levering af genterapi til flere okulære væv på en sikker, nem og effektiv måde. Det kan også tilpasses til intrastromale og subretinale injektioner hos små dyr. Brug af den subkonjunktive injektionsvej er minimal invasiv.Det udgør færre risici og har store løfter om AV levering til behandling af flere okulære sygdomme. Med over 1 milliard mennesker verden over, der lider af synshandicap, giver brugen af en sikker og nem metode til lægemiddellevering bred anvendelighed til behandling af mange forskellige årsager til blindhed. Genleveringsmetoderne beskrevet i denne protokol er af særlig interesse for dem, der udvikler potentielle interventionsstrategier og praktiserende øjenlæger, som i sidste ende vil levere disse lægemidler til patienter.Den største udfordring for en person, der udfører denne protokol for første gang, er sandsynligvis indsættelsen af nålen i konceptkonjunktivalrummet. Til at begynde med skal du samle injektionssystemet ved at placere et stereomikroskop og en sprøjtepumpe i et biosikkerhedsskab. Skær derefter polyethylenslangen i en længde på ca. 50 centimeter.Indsæt enden af en 36-gauge nål i den ene ende af slangen. Fyld derefter en engangssprøjte på 3 milliliter med sterilt vand og indsæt den i siden af røret modsat nålen. Skyl slangen tre gange, skift mellem sterilt vand og 70% alkohol for at desinficere slangen og sørg for, at der ikke er lækager, træsko eller skader i hele slangen.Brug engangssprøjten på 3 milliliter til at fylde slangen med sterilt vand og lade slangen sidde fast på engangssprøjten. Placer derefter et stykke parafoam på overfladen af biosikkerhedsskabet, og tilsæt en pool med sterilt vand til det. Nedsænk den del af slangen, der er forbundet med nålen, i puljen af sterilt vand.Træk derefter engangssprøjten ud af røråbningen for at forhindre luft i at komme ind i slangesystemet, når sprøjten fjernes. Fyld derefter en 10-mikroliter Hamilton sprøjte med sterilt vand. Tilslut derefter Hamilton-sprøjtenålen til den åbne ende af slangen ved at nedsænke kanylespidsen på Hamilton-sprøjten i puljen af sterilt vand på parafilmen.Tryk og hold den hurtige bakknap på pumpeskærmen nede for at flytte skubbeblokkene til sprøjtens omtrentlige længde. Skru derefter beslagets fastspændingsknapper af for at løsne fastholdelsesbeslagene på skubberen og sprøjteholderblokkene. Læg derefter Hamilton-sprøjten på sprøjteholderblokken, og fastgør sprøjten i overensstemmelse med producentens anvisninger.For at justere parametrene på pumpeindstillingsskærmen skal du trykke på knappen Force"og indstille kraftniveauet til 30% Accepter derefter ændringerne for at gå tilbage til indstillingsskærmen. Tryk på knappen Hurtig start", vælg Metode, og vælg derefter Infuse Only". For sprøjteindstillingen skal du vælge Hamilton 1700 og derefter klikke på Glas"og vælg 10 mikroliter.Senere skal du vælge infusionshastigheden og injektionsvolumenet. Skub vandet ud af Hamilton-sprøjten, mens slangen og injektionsnålen efterlades fuld af vand ved at trykke på knappen Infuse". Træk derefter virussen tilbage ved at placere injektionsnålen i en aliquot af virusbestanden.Træk derefter lidt tilbage på Hamilton-sprøjten ved at trykke på den omvendte knap for at introducere en lille luftboble i slangen. Efter bedøvelse af dyret, tag bindehinden med tang. Indsæt derefter nålen i bindehinden, indtil skråningen er helt dækket af konjunktivalmembranen, og læg nålen mod kloden.Start samtidig injektionen ved at trykke på Start"-knappen ved hjælp af fodkontakten. For at undersøge fordelingen af AAV-vektoren blev det okulære og omgivende væv farvet med hæmatoxylin og eosin. De repræsentative sagittale sektioner viste, at spredningen af indisk blæk hovedsageligt forekom ved siden af de ekstraokulære muskler i den ydre overflade af sclera i det periokulære løse bindevæv.For at bekræfte transduktion af selvsupplerende AAV 8 otte uger efter injektion blev grøn fluorescensproteinforekomst i tværsnittene undersøgt ved immunfluorescensfarvning. Resultaterne afslørede, at AAV 8-vektorer effektivt transducerede de periokulære muskler bagud til øjet og hornhinden. For at analysere vektorbiofordelingen blev vektorgenomkopinumre og forskellige øjenrum i andre organer, herunder lever og hjerte, undersøgt ved kvantitativ polymerasekædereaktion ved anvendelse af primere og sonder, der er specifikke for transgenet.Ekspression af transgenet blev bekræftet ved kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion, hvilket antydede, at den subkonjunktive injektion af AAV 8 resulterer i transgenekspression i øjenlåget, bindehinden, hornhinden og synsnerven. Luftboblen vil tjene som en barriere mellem vandet i røret og det terapeutiske lægemiddel. Denne teknik gør det muligt for andre forskere at undersøge brugen af den subkonjunktive administrationsvej til både oftalmiske opløsninger og okulære genterapier til flere sygdomme.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokol for Long Duration Whole Body Hypertermi i mus

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

En Isoleret Working Heart System for Produktionsdyr og Modeller

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Brug Adenoassocieret virus som værktøj til at studere Retinale Barrierer i Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Højfrekvente Ultrasound Imaging af Mouse Cervikal lymfeknuder

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluering af fraktur Callus udvikling under knogleheling i mus ved hjælp af en Mr-kompatible osteosyntese enhed for musen lårben

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-associeret Virus-medieret levering af CRISPR for hjerte gen redigering i mus

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Kontinuerlig blodprøvetagning i små dyr Positron emission Tomography/computertomografi gør det muligt at måle den arterielle indgangsfunktion

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...