Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

De auteurs bedanken de Vector Core aan de Universiteit van North Carolina voor het verstrekken van de scAAV8-GFP-vectoren die in deze studie worden gebruikt, de CGIBD Histology Core en het laboratorium van Dr. Brian C. Gilger voor hun hulp bij de klinische beoordelingsaspecten van deze studie. Deze studie werd ondersteund door de Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship en een Career Development Award van de American Society of Gene &Cell Therapy en de Cystic Fibrosis Foundation. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de American Society of Gene &Cell Therapy of de Cystic Fibrosis Foundation.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. Het gebruik van AAV-vectoren is een biorisico van bioveiligheidsniveau 1. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een bril bij het hanteren van AAV. Voor het hierin beschreven experiment werd een recombinante AAV-vector gebruikt, verpakt met het serotype 8-kapsel en coderend voor een...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

AAV-gemedieerde gentherapie heeft een groot potentieel voor de behandeling van oogziekten. De huidige oculaire gentherapie is gebaseerd op twee belangrijke lokale toedieningsroutes, intravitreale en subretinale injecties. Helaas zijn beide routes invasief en kunnen ze ernstige complicaties veroorzaken, waaronder netvliesloslating, cataractvorming en endoftalmitis. Het onderzoek naar relatief minder invasieve routes, zoals SCJ-injectie, is dus van groot belang.
Hoewel deze techniek relatief een...

Oogziekten omvatten een breed scala aan zowel genetische als verworven aandoeningen. In 2015 waren wereldwijd naar schatting 36 miljoen mensen juridisch blind en meer dan 1 miljard mensen lijden aan ten minste een zekere mate van visuele beperking, wat de noodzaak benadrukt om de verlichtingsinspanningen op alle niveausop te schalen 1. De belangrijkste methoden voor het toedienen van oculaire medicijnen omvatten zowel topische als lokale toediening, zoals oogdruppels of subconjunctivale (SCJ), intracamerale, intravitreale en subretinale injecties. Hoewel niet-invasieve topische therapie de meest voorkomende toedieningsmethode is voor oogheelkundige geneesmiddelen en op grote schaal wordt gebruikt voor veel anterieure segmentaandoeningen, vormt de aanwezigheid van cornea-anatomische barrières een uitdaging voor de biologische beschikbaarheid, biodistributie en werkzaamheid van topisch toegediende stoffen, wat suggereert dat het misschien niet de beste kandidaat-behandelingsroute is voor veel ziekten van het binnenste oog. Lokale injectie in het specifieke oculaire compartiment dat door de ziekte is aangetast, is waarschijnlijk een effectievere en gerichtere aanpak voor medicijnafgifte2. Bijwerkingen als gevolg van herhaalde injecties kunnen toedieningsstrategieën echter bemoeilijken. Idealiter zou een therapie de therapeutische werkzaamheid op lange termijn moeten behouden na een enkele toediening. Gentherapie is dus een veelbelovende optie om het aantal vereiste injecties te minimaliseren en duurzame transgene expressie te bieden voor de behandeling van oogziekte 3,4.
Talrijke virale en niet-virale vectoren zijn beschikbaar voor gentherapie; AAV-vectoren zijn echter van groot belang vanwege hun uitstekende veiligheidsprofiel. AAV is een klein, enkelstrengs, niet-omhuld DNA-virus dat aanvankelijk werd ontdekt als een verontreiniging van een adenoviruspreparaat in 1965 door Atchison et al.5,6 AAV werd vervolgens ontworpen als een efficiënte virale vector voor genafgifte in de jaren 1980 en is de gentherapievector bij uitstek geworden voor vele ziekten, waaronder oogaandoeningen, in de afgelopen decennia. De meest opvallende hiervan is het eerste commercieel beschikbare gentherapiegeneesmiddel, voretigene neparvovec, dat werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration voor de behandeling van Leber's Congenitale Amaurosis, een zeldzame posterieure oogziekte. Hoewel voretigene neparvovec met succes barrières voor klinische ontwikkeling heeft overwonnen, blijven er uitdagingen voor de commercialisering van aanvullende oculaire gentherapieën. Voretigene neparvovec wordt bijvoorbeeld toegediend aan patiënten die levensvatbare retinale cellen behouden via subretinale injectie. Patiënten met meer geavanceerde vormen van de ziekte die geen levensvatbare retinale cellen hebben, komen dus niet in aanmerking voor behandeling, omdat dit geen klinisch voordeel zou opleveren. Bovendien werden bekende complicaties geassocieerd met de subretinale injectieprocedure waargenomen, waaronder oogontsteking, cataract, retinale scheuren, maculopathie en pijn 7,8. Andere zorgen met betrekking tot deze procedure zijn de mogelijkheid van bloeding, netvliesloslating, endoftalmitis en intrekking van de oculaire immuunprivilegestatus door oogweefselvernietiging 9,10,11,12. Inspanningen om minder invasieve genafgifteroutes zoals SCJ-injectie te verkennen, zijn dus steeds belangrijker geworden 13,14,15,16,17.
Het bindvlies is een dun membraan dat 3-5 lagen cellen bevat en het voorste oog verbindt met het binnenste ooglid. SCJ-injecties worden klinisch gebruikt voor de toediening van oogheelkundige geneesmiddelen aan zowel de voorste als/of achterste segmenten van het oog voor de behandeling van oogziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, glaucoom, retinitis en posterieure uveïtis18,19. Ze zijn relatief eenvoudig uit te voeren, routinematig gebruikt voor de toediening van oogheelkundige geneesmiddelen in een poliklinische setting20, enigszins pijnloos, brengen het oculaire immuunprivilege niet in gevaar en laten toegediende geneesmiddelen zich verspreiden door een groot periorbitaal gebied dat de oogzenuw omvat. Vandaar dat SCJ-injecties een aantrekkelijke toedieningsweg zijn voor AAV-gentherapietoepassingen. Natuurlijke AAV-serotypen toegediend via SCJ-injectie bij muizen zijn eerder gekarakteriseerd voor veiligheid, transductie-efficiëntie, serumimmunogeniciteit, biodistributie en weefselspecificiteit 13,16,21. Deze gegevens toonden aan dat genafgifte aan individuele oculaire weefsels via SCJ-toediening een formele mogelijkheid is.
Dit artikel beschrijft een eenvoudig en aanpasbaar protocol voor SCJ-injectie om AAV-vectoren in een muismodel af te leveren. Om de reproduceerbaarheid van deze aanpak te waarborgen, wordt een injectiesysteem beschreven dat bestaat uit een stereomicroscoop, een programmeerbare infusie-/opzuigspuitpomp (die een consistente en nauwkeurige injectiesnelheid en -druk mogelijk maakt) en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit systeem is aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes zoals intrastromale, intracamerale, intravitreale en subretinale injecties bij kleine dieren. Bovendien wordt een fluoresceïnekleurstof vaak gebruikt om visualisatie van de AAV-injectieplaats mogelijk te maken. De belangrijkste praktische stappen in de toedieningsroute, de installatie van het injectieplatform, de voorbereiding van de injectie en tips uit directe ervaring zullen in detail worden besproken. Ten slotte zullen gemeenschappelijke validatietechnieken voor bevestiging van AAV-levering aan de gewenste weefsels kort worden besproken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Oogziekten omvatten een breed scala aan erfelijke genetische en verworven aandoeningen die aantrekkelijke doelwitten zijn voor lokale medicijnafgifte vanwege hun relatieve gemakkelijke toegankelijkheid via meerdere toedieningsroutes. Subconjunctivale (SCJ) injecties bieden voordelen ten opzichte van andere intraoculaire toedieningsroutes omdat ze eenvoudig, veilig en meestal worden uitgevoerd in een poliklinische setting. SCJ-injecties bij kleine dieren vereisen meestal de hulp van een operatiemicroscoop vanwege de grootte van het oog. Eerder werk heeft aangetoond dat SCJ-injectie van specifieke adeno-geassocieerde virus (AAV) serotypen een geldige genafgiftestrategie is voor gerichte transductie van het oculaire oppervlak, de oogspier, het hoornvlies en de oogzenuw, wat een potentiële aanpak biedt voor de behandeling van veel oogziekten.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor SCJ-injecties in een muismodel met behulp van een injectiesysteem dat bestaat uit een programmeerbare infusie- / opzuigspuitpomp (die een consistente en nauwkeurige injectiesnelheid en -druk mogelijk maakt) en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Het injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes zoals intrastromale, intracamerale, intravitreale en subretinale injecties bij kleine dieren. Hoewel de levering van adeno-geassocieerde virale vectoren voor oculaire gentherapiestudies wordt beschreven, kan het protocol hierin ook worden aangepast voor een verscheidenheid aan oogheelkundige oplossingen in modellen voor kleine dieren. De belangrijkste praktische stappen in de toedieningsroute, de installatie van het injectieplatform, de voorbereiding van de injectie en tips uit directe ervaring zullen in detail worden besproken. Daarnaast zullen ook algemene validatietechnieken voor AAV-leveringsbevestiging aan de gewenste weefsels kort worden besproken.

Oplossing geïnjecteerd in de subconjunctivale ruimte presenteert zich als een bleb, afhankelijk van het injectievolume. In dit experiment werd 7 μL AAV (7 × 109 virale genomen (vg)/oog) gemengd met fluoresceïne in een uiteindelijke concentratie van 0,1% geïnjecteerd met een naald van 36 G onder een stereomicroscoop, en de injectiesnelheid/druk werd constant gehouden met behulp van een programmeerbare spuitpomp op 1 μL/s. Een bleb kan verschijnen bij injectie (pijl). Een microscopisch ...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Dit protocol biedt een methode voor gentherapie die op een veilige, gemakkelijke en effectieve manier aan meerdere oogweefsels wordt toegediend. Het is ook aanpasbaar voor intrastromale en subretinale injecties bij kleine dieren. Het gebruik van de subconjunctivale injectieroute is minimaal invasief.Het brengt minder risico's met zich mee en houdt een grote belofte in voor AV-toediening om meerdere oogziekten te behandelen. Met meer dan 1 miljard mensen wereldwijd die lijden aan visuele beperkingen, biedt het gebruik van een veilige en eenvoudige methode voor medicijnafgifte een brede toepasbaarheid voor de behandeling van veel verschillende oorzaken van blindheid. De genafgiftemethoden die in dit protocol worden beschreven, zijn van bijzonder belang voor degenen die potentiële interventiestrategieën ontwikkelen en oogartsen beoefenen, die deze geneesmiddelen uiteindelijk aan patiënten zullen leveren.De grootste uitdaging voor iemand die dit protocol voor het eerst uitvoert, is waarschijnlijk het inbrengen van de naald in de concept conjunctivale ruimte. Om te beginnen, monteer het injectiesysteem door een stereomicroscoop en een spuitpomp in een bioveiligheidskast te plaatsen. Snijd vervolgens de polyethyleenbuis tot een lengte van ongeveer 50 centimeter.Steek het uiteinde van een naald van 36 gauge in het ene uiteinde van de buis. Vul vervolgens een wegwerpspuit van 3 milliliter met steriel water en steek deze in de zijkant van de buis tegenover de naald. Spoel de slang drie keer door, afwisselend steriel water en 70% alcohol om de slang te desinfecteren en ervoor te zorgen dat er geen lekken, verstoppingen of schade in de slang zijn.Vul met de wegwerpspuit van 3 milliliter de slang met steriel water en laat de slang aan de wegwerpspuit zitten. Plaats vervolgens een stuk parafoam op het oppervlak van de bioveiligheidskast en voeg er een plas steriel water aan toe. Dompel het deel van de buis dat op de naald is aangesloten onder in de plas steriel water.Trek vervolgens de wegwerpspuit uit de buisopening om te voorkomen dat er lucht in het slangsysteem komt bij het verwijderen van de spuit. Vul vervolgens een Hamilton spuit van 10 microliter met steriel water. Sluit vervolgens de Hamilton spuitnaald aan op het open uiteinde van de slang door de naaldpunt van de Hamilton-spuit onder te dompelen in de plas steriel water op de parafilm.Houd de snelomkeerknop op het pompscherm ingedrukt om de duwblokken naar de geschatte lengte van de spuit te verplaatsen. Schroef vervolgens de klemknoppen van de beugel los om de bevestigingsbeugels op de duwer en de spuithouderblokken los te maken. Plaats vervolgens de Hamilton-spuit op het spuithouderblok en bevestig de spuit volgens de instructies van de fabrikant.Om de parameters in het pompinstellingsscherm aan te passen, drukt u op de Force"-knop en stelt u het krachtniveau in op 30%Accepteer vervolgens de wijzigingen om terug te gaan naar het instellingsscherm. Druk op de knop Snel aan de slag, selecteer Methode en selecteer vervolgens de optie Alleen infuseren. Voor de spuitoptie selecteert u Hamilton 1700, klikt u vervolgens op Glas" en selecteert u 10 microliter.Selecteer later de infusiesnelheid en het injectievolume. Werp het water uit de Hamilton-spuit terwijl u de slang en injectienaald vol water laat zitten door op de knop Infuse" te drukken. Trek vervolgens het virus op door de injectienaald in een aliquot van de virusvoorraad te plaatsen.Trek vervolgens de Hamilton-spuit iets terug door op de omgekeerde knop te drukken om een kleine luchtbel in de slang te brengen. Na het verdoven van het dier, pak je het bindvlies vast met een tang. Steek vervolgens de naald in het bindvlies totdat de schuine kant volledig bedekt is door het conjunctivale membraan en leg de naald tegen de bol.Start tegelijkertijd de injectie door op de Start-knop te drukken met behulp van de voetschakelaar. Om de verdeling van de AAV-vector te onderzoeken, werden de oculaire en omliggende weefsels gekleurd met hematoxyline en eosine. De representatieve sagittale secties toonden aan dat de dispersie van Indiase inkt voornamelijk plaatsvond naast de extraoculaire spieren in het buitenoppervlak van de sclera in de perioculaire losse bindweefsels.Om de transductie van zelfcomplementaire AAV 8 acht weken na injectie te bevestigen, werd de overvloed aan groene fluorescentie-eiwitten in de doorsneden onderzocht door immunofluorescentiekleuring. De resultaten toonden aan dat AAV 8-vectoren de perioculaire spieren achter het oog en het hoornvlies efficiënt transduceerden. Om de vectorbiodistributie te analyseren, werden vectorgenoomkopienummers en verschillende oogcompartimenten in andere organen, waaronder lever en hart, onderzocht door kwantitatieve polymerasekettingreactie met behulp van primers en sondes die specifiek zijn voor het transgen.Expressie van het transgen werd bevestigd door kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie, die suggereerde dat de subconjunctivale injectie van AAV 8 resulteert in transgene expressie in het ooglid, bindvlies, hoornvlies en oogzenuw. De luchtbel zal dienen als een barrière tussen het water in de buis en het therapeutische medicijn. Deze techniek stelt andere onderzoekers in staat om het gebruik van de subconjunctivale toedieningsroute te onderzoeken voor zowel oogheelkundige oplossingen als oculaire gentherapieën voor meerdere ziekten.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protocol voor Long Duration Whole Body Hyperthermie in Muizen

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Een GeÃ ¯ soleerde Werken Hart voor grote Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Hoge-frequentie Ultrasound Imaging van de muis cervicale lymfeklieren

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluatie van de fractuur Callus ontwikkeling tijdens het bot genezing in muizen met behulp van een MRI-compatibele osteosynthese apparaat voor de muis dijbeen

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

Continue bloedafname in kleine dierlijke positron emissie tomografie/computertomografie maakt de meting van de arteriële ingangsfunctie mogelijk

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...