Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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Les auteurs remercient le Vector Core de l’Université de Caroline du Nord d’avoir fourni les vecteurs scAAV8-GFP utilisés dans cette étude, le CGIBD Histology Core et le laboratoire du Dr Brian C. Gilger pour leur aide dans les aspects d’évaluation clinique de cette étude. Cette étude a été soutenue par la bourse postdoctorale distinguée Pfizer-NC Biotech et une bourse de développement de carrière de l’American Society of Gene & Cell Therapy et de la Cystic Fibrosis Foundation. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’American Society of Gene & Cell Therapy ou de la Cystic Fibrosis Foundation.

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux règlements du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. L’utilisation de vecteurs AAV constitue un risque de biodanger de niveau de biosécurité 1. Portez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection lorsque vous manipulez un véhicule antialcoolique. Pour l’expérience décrite...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. 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C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

La thérapie génique médiée par AAV présente un grand potentiel pour le traitement des maladies oculaires. La thérapie génique oculaire actuelle repose sur deux voies d’administration locales majeures, les injections intravitréennes et sous-rétiniennes. Malheureusement, les deux voies sont invasives et peuvent entraîner de graves complications, notamment un décollement de la rétine, la formation de cataracte et une endophtalmie. Ainsi, l’étude de voies relativement moins invasives, telles que l’injectio...

Les maladies oculaires englobent un large éventail de troubles génétiques et acquis. En 2015, on estimait à 36 millions le nombre de personnes aveugles au sens de la loi dans le monde et à plus d’un milliard le nombre de personnes souffrant d’au moins un certain niveau de déficience visuelle, ce qui souligne la nécessité d’intensifier les efforts d’atténuation à tous les niveaux1. Les principales méthodes d’administration des médicaments oculaires comprennent l’administration topique et locale, comme les gouttes oculaires ou sous-conjonctivales (SCJ), les injections intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes. Bien que le traitement topique non invasif soit la méthode d’administration la plus courante pour les médicaments ophtalmiques et qu’il soit largement utilisé pour de nombreux troubles du segment antérieur, la présence de barrières anatomiques cornéennes présente un défi pour la biodisponibilité, la biodistribution et l’efficacité des substances administrées par voie topique, ce qui suggère que ce n’est peut-être pas la meilleure voie de traitement candidate pour de nombreuses maladies de l’œil interne. L’injection locale dans le compartiment oculaire spécifique affecté par la maladie est susceptible d’être une approche d’administration de médicaments plus efficace et ciblée2. Cependant, les effets indésirables résultant d’injections répétées peuvent compliquer les stratégies d’administration. Idéalement, une thérapie devrait maintenir son efficacité thérapeutique à long terme après une administration unique. Ainsi, la thérapie génique est une option prometteuse pour minimiser le nombre d’injections nécessaires et fournir une expression transgénique soutenue pour le traitement de la maladie oculaire 3,4.
De nombreux vecteurs viraux et non viraux sont disponibles pour la thérapie génique; cependant, les vecteurs AAV présentent un grand intérêt en raison de leur excellent profil d’innocuité. AAV est un petit virus à ADN simple brin non enveloppé qui a été initialement découvert comme contaminant d’une préparation d’adénovirus en 1965 par Atchison et al.5,6 L’AAV a ensuite été conçu comme un vecteur viral efficace pour l’administration de gènes dans les années 1980 et est devenu le vecteur de thérapie génique de choix pour de nombreuses maladies, y compris les troubles oculaires, au cours des dernières décennies. Le plus notable d’entre eux est le premier médicament de thérapie génique disponible dans le commerce, voretigene neparvovec, qui a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour traiter l’amaurose congénitale de Leber, une maladie oculaire postérieure rare. Bien que voretigene neparvovec ait réussi à surmonter les obstacles au développement clinique, des défis subsistent pour la commercialisation de thérapies géniques oculaires supplémentaires. Par exemple, voretigene neparvovec est administré aux patients qui conservent des cellules rétiniennes viables par injection sous-rétinienne. Ainsi, les patients atteints de formes plus avancées de la maladie qui manquent de cellules rétiniennes viables ne sont pas éligibles au traitement, car il n’apporterait aucun bénéfice clinique. De plus, des complications connues associées à la procédure d’injection sous-rétinienne ont été observées, notamment une inflammation oculaire, des cataractes, des déchirures rétiniennes, une maculopathie et des douleurs 7,8. D’autres préoccupations liées à cette procédure comprennent la possibilité d’hémorragie, de décollement de la rétine, d’endophtalmie et de révocation du statut privilégié immunitaire oculaire par destruction des tissus oculaires 9,10,11,12. Ainsi, les efforts visant à explorer des voies d’administration de gènes moins invasives telles que l’injection de SCJ sont devenus de plus en plus importants 13,14,15,16,17.
La conjonctive est une fine membrane contenant 3 à 5 couches de cellules et reliant l’œil antérieur à la paupière interne. Les injections de SCJ sont utilisées cliniquement pour l’administration de médicaments ophtalmiques aux segments antérieur et / ou postérieur de l’œil pour le traitement de maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, le glaucome, la rétinite et l’uvéite postérieure18,19. Ils sont relativement simples à réaliser, utilisés couramment pour l’administration de médicaments ophtalmiques en ambulatoire20, quelque peu indolores, ne compromettent pas le privilège immunitaire oculaire et permettent aux médicaments administrés de se propager dans une grande région périorbitaire qui englobe le nerf optique. Par conséquent, les injections de SCJ sont une voie d’administration intéressante pour les applications de thérapie génique AAV. Les sérotypes naturels AAV administrés par injection de SCJ chez la souris ont déjà été caractérisés pour leur innocuité, leur efficacité de transduction, leur immunogénicité sérique, leur biodistribution et leur spécificité tissulaire13,16,21. Ces données ont démontré que l’administration de gènes à des tissus oculaires individuels par administration de SCJ est une possibilité formelle.
Cet article décrit un protocole simple et adaptable pour l’injection de SCJ afin de délivrer des vecteurs AAV dans un modèle murin. Pour assurer la reproductibilité de cette approche, un système d’injection composé d’un stéréomicroscope, d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche aux gaz couplée à des aiguilles de micro-injection est décrit. Ce système est adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. De plus, un colorant fluorescéine est souvent utilisé pour permettre la visualisation du site d’injection d’AAV. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. Enfin, les techniques de validation communes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront brièvement discutées.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Les maladies oculaires comprennent un large éventail de maladies génétiques héréditaires et acquises qui sont des cibles attrayantes pour l’administration locale de médicaments en raison de leur relative facilité d’accès via de multiples voies d’administration. Les injections sous-conjonctivales (SCJ) offrent des avantages par rapport aux autres voies d’administration intraoculaires car elles sont simples, sûres et généralement effectuées en ambulatoire. Les injections de SCJ chez les petits animaux nécessitent généralement l’aide d’un microscope opératoire en raison de la taille de l’œil. Des travaux antérieurs ont démontré que l’injection par SCJ de sérotypes spécifiques de virus adéno-associés (AAV) est une stratégie d’administration génique valide pour la transduction ciblée de la surface oculaire, du muscle oculaire, de la cornée et du nerf optique, offrant une approche potentielle pour le traitement de nombreuses maladies oculaires.
Ici, un protocole détaillé est présenté pour les injections de SCJ dans un modèle murin utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Le système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamériennes, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. Bien que l’administration de vecteurs viraux adéno-associés pour les études de thérapie génique oculaire soit décrite, le protocole présent peut également être adapté à une variété de solutions ophtalmiques dans de petits modèles animaux. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. En outre, les techniques de validation courantes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront également brièvement discutées.

La solution injectée dans l’espace sous-conjonctival se présente sous la forme d’un bleb en fonction du volume d’injection. Dans cette expérience, 7 μL d’AAV (7 × 109 génomes viraux (vg)/œil) mélangés à de la fluorescéine à une concentration finale de 0,1 % ont été injectés avec une aiguille de 36 G sous un stéréomicroscope, et la vitesse/pression d’injection a été maintenue constante à l’aide d’une pompe à seringue programmable à 1 μL/s. Un bleb peut ap...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Dans ce manuscrit, l’injection sous-conjonctivale est démontrée comme une méthode d’administration vectorielle valide pour les tissus oculaires chez la souris utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue de perfusion / retrait et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Ce système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires.

Administration sous-conjonctivale de vecteurs de virus adéno-associés dans des modèles de petits animaux

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Ce protocole offre une méthode d’administration de thérapie génique à plusieurs tissus oculaires d’une manière sûre, facile et efficace. Il est également adaptable pour les injections intrastromales et sous-rétiniennes chez les petits animaux. L’utilisation de la voie d’injection sous-conjonctivale est peu invasive.Il présente moins de risques et est très prometteur pour l’administration AV pour traiter plusieurs maladies oculaires. Avec plus de 1 milliard de personnes dans le monde souffrant de déficience visuelle, l’utilisation d’une méthode sûre et facile pour l’administration de médicaments offre une large applicabilité pour le traitement de nombreuses causes différentes de cécité. Les méthodes d’administration de gènes décrites dans ce protocole présentent un intérêt particulier pour ceux qui développent des stratégies d’intervention potentielles et les ophtalmologistes praticiens, qui finiront par administrer ces médicaments aux patients.Le plus grand défi pour quelqu’un qui exécute ce protocole pour la première fois est probablement l’insertion de l’aiguille dans l’espace conjonctival conceptuel. Pour commencer, assemblez le système d’injection en plaçant un stéréomicroscope et une pompe à seringue dans une armoire de biosécurité. Ensuite, coupez le tube en polyéthylène à une longueur d’environ 50 centimètres.Insérez l’extrémité d’une aiguille de calibre 36 dans une extrémité du tube. Ensuite, remplissez une seringue jetable de 3 millilitres avec de l’eau stérile et insérez-la dans le côté du tube opposé à l’aiguille. Rincez le tube trois fois, en alternant entre de l’eau stérile et de l’alcool à 70% pour désinfecter le tube et vous assurer qu’il n’y a pas de fuites, de sabots ou de dommages dans tout le tube.À l’aide de la seringue jetable de 3 millilitres, remplissez le tube avec de l’eau stérile et laissez le tube attaché à la seringue jetable. Ensuite, placez un morceau de paramousse sur la surface de l’armoire de biosécurité et ajoutez-y une piscine d’eau stérile. Immergez la partie du tube reliée à l’aiguille dans la piscine d’eau stérile.Ensuite, retirez la seringue jetable de l’ouverture du tube pour empêcher tout air de pénétrer dans le système de tubulure lors du retrait de la seringue. Remplissez ensuite une seringue Hamilton de 10 microlitres avec de l’eau stérile. Ensuite, connectez l’aiguille de la seringue Hamilton à l’extrémité ouverte du tube en immergeant l’extrémité de l’aiguille de la seringue Hamilton dans la flaque d’eau stérile sur le film para.Appuyez sur le bouton d’inversion rapide sur l’écran de la pompe et maintenez-le enfoncé pour déplacer les blocs poussoirs à la longueur approximative de la seringue. Ensuite, dévissez les boutons de serrage du support pour desserrer les supports de fixation du poussoir et des blocs porte-seringues. Ensuite, chargez la seringue Hamilton sur le bloc porte-seringue et fixez la seringue en suivant les instructions du fabricant.Pour régler les paramètres dans l’écran de réglage de la pompe, appuyez sur le bouton Forcer et réglez le niveau de force à 30%Puis acceptez les modifications pour revenir à l’écran de réglage. Appuyez sur le bouton Démarrage rapide, sélectionnez Méthode, puis sélectionnez l’option Infuser uniquement. Pour l’option seringue, sélectionnez Hamilton 1700, puis cliquez sur Glass et sélectionnez 10 microlitres.Plus tard, sélectionnez le débit de perfusion et le volume d’injection. Éjectez l’eau de la seringue Hamilton tout en laissant la tubulure et l’aiguille d’injection pleines d’eau en appuyant sur le bouton Infuse. Ensuite, retirez le virus en plaçant l’aiguille d’injection dans une partie aliquote du stock de virus.Ensuite, tirez légèrement sur la seringue Hamilton en appuyant sur le bouton inverse pour introduire une petite bulle d’air dans le tube. Après avoir anesthésié l’animal, saisissez la conjonctive avec une pince. Insérez ensuite l’aiguille dans la conjonctive jusqu’à ce que le biseau soit entièrement recouvert par la membrane conjonctivale, et posez l’aiguille contre le globe.Simultanément, lancez l’injection en appuyant sur le bouton Start à l’aide de la pédale de commande. Pour examiner la distribution du vecteur AAV, les tissus oculaires et environnants ont été colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Les coupes sagittales représentatives ont démontré que la dispersion de l’encre de Chine se produisait principalement à côté des muscles extraoculaires de la surface externe de la sclérotique dans les tissus conjonctifs lâches périoculaires.Pour confirmer la transduction de l’AAV 8 auto-complémentaire huit semaines après l’injection, l’abondance des protéines de fluorescence verte dans les coupes transversales a été examinée par coloration par immunofluorescence. Les résultats ont révélé que les vecteurs AAV 8 transduisaient efficacement les muscles périoculaires postérieurs à l’œil et à la cornée. Pour analyser la biodistribution du vecteur, le nombre de copies du génome du vecteur et les compartiments oculaires distincts dans d’autres organes, y compris le foie et le cœur, ont été examinés par réaction en chaîne de la polymérase quantitative à l’aide d’amorces et de sondes spécifiques au transgène.L’expression du transgène a été confirmée par une réaction en chaîne de la polymérase quantitative de transcription inverse, qui suggère que l’injection sous-conjonctivale d’AAV 8 entraîne l’expression du transgène dans la paupière, la conjonctive, la cornée et le nerf optique. La bulle d’air servira de barrière entre l’eau dans le tube et le médicament thérapeutique. Cette technique permet à d’autres chercheurs d’explorer l’utilisation de la voie d’administration sous-conjonctivale pour les solutions ophtalmiques et les thérapies géniques oculaires pour de multiples maladies.

Research

JoVE Journal

Medicine

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