Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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Die Autoren danken dem Vector Core an der University of North Carolina für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten scAAV8-GFP-Vektoren, dem CGIBD Histology Core und dem Labor von Dr. Brian C. Gilger für ihre Unterstützung bei den klinischen Bewertungsaspekten dieser Studie. Diese Studie wurde durch das Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship und einen Career Development Award der American Society of Gene & Cell Therapy und der Cystic Fibrosis Foundation unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der American Society of Gene & Cell Therapy oder der Cystic Fibrosis Foundation dar.

Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of North Carolina at Chapel Hill durchgeführt. Die Verwendung von AAV-Vektoren ist ein Biosicherheitsrisiko der Stufe 1. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille, wenn Sie mit AAV umgehen. Für das hierin beschriebene Experiment wurde ein rekombinanter AAV-Vektor verwendet, der mit dem Serotyp-8-Kapsid verpackt ist und f?...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. 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C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

Die AAV-vermittelte Gentherapie birgt großes Potenzial für die Behandlung von Augenerkrankungen. Die derzeitige okuläre Gentherapie beruht auf zwei wichtigen lokalen Verabreichungswegen, intravitrealen und subretinalen Injektionen. Leider sind beide Wege invasiv und können schwerwiegende Komplikationen verursachen, einschließlich Netzhautablösung, Kataraktbildung und Endophthalmitis. Daher ist die Untersuchung von relativ weniger invasiven Wegen, wie der SCJ-Injektion, von großem Interesse.
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Augenerkrankungen umfassen ein breites Spektrum sowohl genetischer als auch erworbener Erkrankungen. Im Jahr 2015 waren schätzungsweise 36 Millionen Menschen weltweit blind, und über 1 Milliarde Menschen leiden zumindest an einem gewissen Grad an Sehbehinderung, was die Notwendigkeit unterstreicht, die Linderungsbemühungen auf allen Ebenen zu verstärken1. Die wichtigsten Methoden zur Verabreichung von Augenmedikamenten umfassen sowohl topische als auch lokale Verabreichung, wie Augentropfen oder subkonjunktivale (SCJ), intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen. Obwohl die nichtinvasive topische Therapie die gebräuchlichste Verabreichungsmethode für ophthalmologische Arzneimittel ist und häufig für viele Erkrankungen des vorderen Abschnitts eingesetzt wird, stellt das Vorhandensein von anatomischen Barrieren der Hornhaut eine Herausforderung für die Bioverfügbarkeit, Bioverteilung und Wirksamkeit topisch verabreichter Substanzen dar, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht der beste Behandlungsweg für viele Erkrankungen des inneren Auges ist. Die lokale Injektion in das spezifische Augenkompartiment, das von der Krankheit betroffen ist, ist wahrscheinlich ein effektiverer und gezielterer Ansatz zur Medikamentenabgabe2. Nebenwirkungen durch wiederholte Injektionen können jedoch die Verabreichungsstrategien erschweren. Idealerweise sollte eine Therapie nach einmaliger Verabreichung eine langfristige therapeutische Wirksamkeit erhalten. Daher ist die Gentherapie eine vielversprechende Option, um die Anzahl der erforderlichen Injektionen zu minimieren und eine nachhaltige Transgenexpression für die Behandlung von Augenerkrankungenbereitzustellen 3,4.
Für die Gentherapie stehen zahlreiche virale und nichtvirale Vektoren zur Verfügung; AAV-Vektoren sind jedoch aufgrund ihres hervorragenden Sicherheitsprofils von großem Interesse. AAV ist ein kleines, einzelsträngiges, unbehülltes DNA-Virus, das ursprünglich 1965 von Atchison et al. als Kontaminante eines Adenovirus-Präparats entdeckt wurde.5,6 AAV wurde später in den 1980er Jahren als effizienter viraler Vektor für die Genabgabe entwickelt und ist zum Gentherapievektor der Wahl für viele Krankheiten, einschließlich Augenerkrankungen, geworden. in den letzten Jahrzehnten. Das bemerkenswerteste davon ist das erste kommerziell erhältliche Gentherapeutikum, Voretigene neparvovec, das von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zur Behandlung der Leberschen kongenitalen Amaurose, einer seltenen hinteren Augenerkrankung, zugelassen wurde. Obwohl Voretigene Neparvovec die Hindernisse für die klinische Entwicklung erfolgreich überwunden hat, bleiben Herausforderungen für die Kommerzialisierung zusätzlicher okulärer Gentherapien bestehen. Zum Beispiel wird Voretigene neparvovec Patienten verabreicht, die lebensfähige Netzhautzellen durch subretinale Injektion erhalten. Daher sind Patienten mit fortgeschritteneren Formen der Krankheit, denen lebensfähige Netzhautzellen fehlen, nicht für eine Behandlung geeignet, da dies keinen klinischen Nutzen bringen würde. Darüber hinaus wurden bekannte Komplikationen im Zusammenhang mit dem subretinalen Injektionsverfahren beobachtet, darunter Augenentzündungen, Katarakte, Netzhautrisse, Makulopathie und Schmerzen 7,8. Andere Bedenken im Zusammenhang mit diesem Verfahren umfassen die Möglichkeit von Blutungen, Netzhautablösung, Endophthalmitis und Aufhebung des privilegierten Status des okulären Immunsystems durch Augengewebezerstörung 9,10,11,12. Daher sind Bemühungen, weniger invasive Gentransportwege wie die SCJ-Injektion zu erforschen, immer wichtiger geworden 13,14,15,16,17.
Die Bindehaut ist eine dünne Membran, die 3-5 Zellschichten enthält und das vordere Auge mit dem inneren Augenlid verbindet. SCJ-Injektionen werden klinisch zur ophthalmologischen Arzneimittelabgabe sowohl an das vordere als auch an das hintere Augensegment zur Behandlung von Augenerkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration, Glaukom, Retinitis und posteriorer Uveitis eingesetzt18,19. Sie sind relativ einfach durchzuführen, routinemäßig für die ophthalmologische Medikamentenabgabe in einer ambulanten Umgebung20, etwas schmerzlos, beeinträchtigen nicht das okuläre Immunprivileg und ermöglichen es verabreichten Medikamenten, sich durch eine große periorbitale Region auszubreiten, die den Sehnerv umfasst. Daher sind SCJ-Injektionen ein attraktiver Verabreichungsweg für AAV-Gentherapieanwendungen. Natürliche AAV-Serotypen, die durch SCJ-Injektion bei Mäusen verabreicht wurden, wurden zuvor hinsichtlich Sicherheit, Transduktionseffizienz, Serumimmunogenität, Bioverteilung und Gewebespezifität charakterisiert13,16,21. Diese Daten zeigten, dass die Genabgabe an einzelne Augengewebe durch SCJ-Verabreichung eine formale Möglichkeit ist.
Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und anpassungsfähiges Protokoll für die SCJ-Injektion, um AAV-Vektoren in einem Mausmodell zu liefern. Um die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes zu gewährleisten, wird ein Injektionssystem beschrieben, das aus einem Stereomikroskop, einer programmierbaren Infusions-/Entnahmespritzenpumpe (die eine konsistente und präzise Einspritzgeschwindigkeit und einen konstanten Druck ermöglicht) und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses System ist für andere intraokulare Verabreichungswege wie intrastromale, intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Darüber hinaus wird häufig ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, um die AAV-Injektionsstelle zu visualisieren. Die wichtigsten praktischen Schritte auf dem Verabreichungsweg, die Einrichtung der Injektionsplattform, die Vorbereitung der Injektion und Tipps aus direkter Erfahrung werden ausführlich besprochen. Schließlich werden gängige Validierungstechniken zur Bestätigung der AAV-Abgabe an das gewünschte Gewebe kurz diskutiert.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Augenerkrankungen umfassen eine breite Palette von erblichen genetischen und erworbenen Erkrankungen, die aufgrund ihrer relativ einfachen Zugänglichkeit über mehrere Verabreichungswege attraktive Ziele für die lokale Medikamentenabgabe sind. Subkonjunktivale (SCJ) Injektionen bieten Vorteile gegenüber anderen intraokularen Verabreichungswegen, da sie einfach, sicher und in der Regel ambulant durchgeführt werden. SCJ-Injektionen bei Kleintieren erfordern aufgrund der Größe des Auges in der Regel die Hilfe eines Operationsmikroskops. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die SCJ-Injektion spezifischer Adeno-assoziierter Virus (AAV) Serotypen eine gültige Genlieferstrategie für die gezielte Transduktion der Augenoberfläche, des Augenmuskels, der Hornhaut und des Sehnervs ist und einen potenziellen Ansatz für die Behandlung vieler Augenerkrankungen bietet.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für SCJ-Injektionen in einem Mausmodell unter Verwendung eines Injektionssystems vorgestellt, das aus einer programmierbaren Infusions-/Entnahmespritzenpumpe (die eine konsistente und präzise Injektionsgeschwindigkeit und einen konstanten Druck ermöglicht) und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Das Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege wie intrastromale, intrakameraale, intravitreale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Obwohl die Abgabe von adeno-assoziierten viralen Vektoren für okuläre Gentherapiestudien beschrieben wird, kann das hierin enthaltene Protokoll auch für eine Vielzahl von ophthalmologischen Lösungen in Kleintiermodellen angepasst werden. Die wichtigsten praktischen Schritte auf dem Verabreichungsweg, die Einrichtung der Injektionsplattform, die Vorbereitung der Injektion und Tipps aus direkter Erfahrung werden ausführlich besprochen. Darüber hinaus werden auch gängige Validierungstechniken für die AAV-Verabreichungsbestätigung an die gewünschten Gewebe kurz besprochen.

Lösung, die in den subkonjunktivalen Raum injiziert wird, präsentiert sich je nach Injektionsvolumen als Blase. In diesem Experiment wurden 7 μL AAV (7 × 109 virale Genome (vg)/Auge), gemischt mit Fluorescein in einer Endkonzentration von 0,1%, mit einer 36 G-Nadel unter einem Stereomikroskop injiziert, und die Injektionsgeschwindigkeit/der Injektionsdruck wurde mit einer programmierbaren Spritzenpumpe bei 1 μL/s konstant gehalten. Bei der Injektion kann eine Blase auftreten (Pfeil). E...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode der Gentherapie-Verabreichung an mehrere Augengewebe auf sichere, einfache und effektive Weise. Es ist auch für intrastromale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Die Verwendung des subkonjunktivalen Injektionsweges ist minimalinvasiv.Es birgt weniger Risiken und ist vielversprechend für die AV-Verabreichung zur Behandlung mehrerer Augenerkrankungen. Mit über 1 Milliarde Menschen weltweit, die an Sehbehinderungen leiden, bietet die Verwendung einer sicheren und einfachen Methode zur Medikamentenabgabe eine breite Anwendbarkeit für die Behandlung vieler verschiedener Ursachen von Erblindung. Die in diesem Protokoll beschriebenen Genabgabemethoden sind von besonderem Interesse für diejenigen, die potenzielle Interventionsstrategien entwickeln und praktizierende Augenärzte praktizieren, die diese Medikamente schließlich an Patienten abgeben werden.Die größte Herausforderung für jemanden, der dieses Protokoll zum ersten Mal durchführt, ist wahrscheinlich das Einführen der Nadel in den Konzeptbindehautraum. Um zu beginnen, bauen Sie das Injektionssystem zusammen, indem Sie ein Stereomikroskop und eine Spritzenpumpe in eine Biosicherheitswerkbank stellen. Als nächstes schneiden Sie den Polyethylenschlauch auf eine Länge von etwa 50 Zentimetern.Führen Sie das Ende einer 36-Gauge-Nadel in ein Ende des Schlauchs ein. Füllen Sie dann eine 3-Milliliter-Einwegspritze mit sterilem Wasser und führen Sie sie in die Seite des Röhrchens gegenüber der Nadel ein. Spülen Sie den Schlauch dreimal abwechselnd mit sterilem Wasser und 70% Alkohol, um den Schlauch zu desinfizieren und sicherzustellen, dass es keine Lecks, Verstopfungen oder Schäden im gesamten Schlauch gibt.Füllen Sie den Schlauch mit der 3-Milliliter-Einwegspritze mit sterilem Wasser und lassen Sie den Schlauch an der Einwegspritze befestigt. Legen Sie dann ein Stück Paraschaum auf die Oberfläche der Biosicherheitswerkbank und fügen Sie einen Pool mit sterilem Wasser hinzu. Tauchen Sie den Teil des Schlauchs, der mit der Nadel verbunden ist, in den Pool mit sterilem Wasser.Als nächstes ziehen Sie die Einwegspritze aus der Schlauchöffnung, um zu verhindern, dass beim Entfernen der Spritze Luft in das Schlauchsystem eindringt. Füllen Sie dann eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser. Als nächstes verbinden Sie die Hamilton-Spritzennadel mit dem offenen Ende des Schlauchs, indem Sie die Nadelspitze der Hamilton-Spritze in den Pool mit sterilem Wasser auf dem Para-Film tauchen.Halten Sie die schnelle Rückwärtstaste auf dem Pumpenbildschirm gedrückt, um die Druckblöcke auf die ungefähre Länge der Spritze zu bewegen. Als nächstes schrauben Sie die Klemmknöpfe der Halterung ab, um die Halteklammern am Drücker und die Spritzenhalterblöcke zu lösen. Legen Sie anschließend die Hamilton-Spritze auf den Spritzenhalterblock und befestigen Sie die Spritze gemäß den Anweisungen des Herstellers.Um die Parameter im Pumpeneinstellungsbildschirm anzupassen, drücken Sie die Taste "Force" und stellen Sie die Kraftstufe auf 30% ein. Akzeptieren Sie dann die Änderungen, um zum Einstellbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnellstart", wählen Sie "Methode" und dann die Option "Nur infundieren". Für die Spritzenoption wählen Sie Hamilton 1700, klicken Sie dann auf "Glas" und wählen Sie 10 Mikroliter.Wählen Sie später die Infusionsrate und das Injektionsvolumen aus. Werfen Sie das Wasser aus der Hamilton-Spritze aus, während Sie den Schlauch und die Injektionsnadel mit Wasser füllen, indem Sie die Infuse"-Taste drücken. Als nächstes ziehen Sie das Virus zurück, indem Sie die Injektionsnadel in ein Aliquot des Virusbestands stecken.Ziehen Sie dann die Hamilton-Spritze leicht zurück, indem Sie die Rückwärtstaste drücken, um eine kleine Luftblase in den Schlauch einzuführen. Nachdem Sie das Tier betäubt haben, greifen Sie die Bindehaut mit einer Pinzette. Führen Sie dann die Nadel in die Bindehaut ein, bis die Abschrägung vollständig von der Bindehautmembran bedeckt ist, und legen Sie die Nadel gegen die Kugel.Starten Sie gleichzeitig die Einspritzung, indem Sie die Starttaste mit dem Fußschalter drücken. Um die Verteilung des AAV-Vektors zu untersuchen, wurden das Augen- und umgebende Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die repräsentativen sagittalen Abschnitte zeigten, dass die Dispersion der indischen Tinte hauptsächlich neben den extraokularen Muskeln in der äußeren Oberfläche der Sklera im periokularen lockeren Bindegewebe auftrat.Um die Transduktion von selbstkomplementärem AAV 8 acht Wochen nach der Injektion zu bestätigen, wurde die Häufigkeit von grün fluoreszierenden Proteinen in den Querschnitten durch Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass AAV 8-Vektoren die periokularen Muskeln hinter dem Auge und der Hornhaut effizient transduzierten. Um die Vektor-Bioverteilung zu analysieren, wurden Vektorgenom-Kopienzahlen und unterschiedliche Augenkompartimente in anderen Organen, einschließlich Leber und Herz, durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primern und Sonden untersucht, die spezifisch für das Transgen sind.Die Expression des Transgens wurde durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion bestätigt, was darauf hindeutet, dass die subkonjunktivale Injektion von AAV 8 zu einer Transgenexpression im Augenlid, in der Bindehaut, in der Hornhaut und im Sehnerv führt. Die Luftblase dient als Barriere zwischen dem Wasser in der Röhre und dem therapeutischen Medikament. Diese Technik ermöglicht es anderen Forschern, die Verwendung des subkonjunktivalen Verabreichungsweges sowohl für ophthalmologische Lösungen als auch für okuläre Gentherapien für mehrere Krankheiten zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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