Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

המחברים מודים לליבה הווקטורית באוניברסיטת צפון קרוליינה על שסיפקה את וקטורי scAAV8-GFP ששימשו במחקר זה, את ליבת ההיסטולוגיה CGIBD ואת המעבדה של ד"ר בריאן סי גילגר על עזרתם בהיבטי ההערכה הקלינית של מחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט המכובדת של פייזר-NC Biotech ופרס פיתוח קריירה מטעם האגודה האמריקאית לריפוי גנים ותאים וקרן סיסטיק פיברוזיס. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של האגודה האמריקאית לריפוי גנטי ותאי או של קרן סיסטיק פיברוזיס.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. השימוש בווקטורים של AAV הוא סיכון ביולוגי ברמה 1. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת טיפול ב-AAV. לצורך הניסוי המתואר כאן, נעשה שימוש בווקטור AA...

<ol>
	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+perspectives+in+ocular+drug+delivery.">Recent perspectives in ocular drug delivery.</a> Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).</li><li>Amado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+subretinal+readministration+of+a+viral+vector+in+large+animals+to+treat+congenital+blindness.">Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness.</a> Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+route+of+AAV2+vector+administration+defines+humoral+immune+response+and+therapeutic+potential.">Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential.</a> Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).</li><li>Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cytomegalovirus+retinitis+in+AIDS+patients+with+intravitreal+ganciclovir.">Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir.</a> Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).</li><li>Miyadera, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastromal+gene+therapy+prevents+and+reverses+advanced+corneal+clouding+in+a+canine+model+of+mucopolysaccharidosis+I.">Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I.</a> Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+survey+of+AAV+gene+delivery+via+subconjunctival+injection+in+mice.">Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice.</a> Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).</li><li>Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+drug+delivery.">Ocular drug delivery.</a> AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).</li><li>Short, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+ocular+drug+delivery+formulations:+techniques+and+practical+considerations.">Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).</li><li>Stevens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administering+a+subconjunctival+injection.">Administering a subconjunctival injection.</a> Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).</li><li>Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

טיפול גנטי בתיווך AAV טומן בחובו פוטנציאל גדול לטיפול במחלות עיניים. הטיפול הגנטי הנוכחי בעיניים מסתמך על שני נתיבי מתן מקומיים עיקריים, זריקות תוך-ורידיות וזריקות תת-רשתיות. למרבה הצער, שני המסלולים פולשניים ועלולים לגרום לסיבוכים חמורים, כולל ניתוק רשתית, היווצרות קטרקט ואנדופתלמיטיס. ל?...

מחלות עיניים מקיפות מגוון רחב של הפרעות גנטיות ונרכשות. בשנת 2015, כ-36 מיליון בני אדם היו עיוורים מבחינה חוקית ברחבי העולם, ויותר ממיליארד בני אדם סובלים לפחות מרמה מסוימת של לקות ראייה, מה שמדגיש את הצורך להרחיב את מאמצי ההקלה בכל הרמות1. השיטות העיקריות למתן תרופות לעיניים כוללות מתן מקומי ומקומי, כגון טיפות עיניים או זריקות תת-קרקעיות (SCJ), תוך-רחמיות, תוך-ורידיות וזריקות תת-קרקעיות. למרות שטיפול מקומי לא פולשני הוא שיטת הלידה הנפוצה ביותר עבור תרופות עיניים והוא נמצא בשימוש נרחב עבור הפרעות מקטעים קדמיים רבות, נוכחותם של מחסומים אנטומיים בקרנית מציבה אתגר לזמינות ביולוגית, פיזור ביולוגי ויעילות של חומרים המנוהלים באופן מקומי, מה שמרמז על כך שזה לא יכול להיות מסלול הטיפול המועמד הטוב ביותר למחלות רבות של העין הפנימית. הזרקה מקומית לתא העין הספציפי המושפע מהמחלה עשויה להיות גישה יעילה וממוקדת יותר להעברת תרופות2. עם זאת, תופעות לוואי הנובעות מזריקות חוזרות ונשנות עלולות לסבך אסטרטגיות ניהול. באופן אידיאלי, טיפול צריך לשמור על יעילות טיפולית ארוכת טווח לאחר מתן יחיד. לפיכך, טיפול גנטי הוא אפשרות מבטיחה למזעור מספר הזריקות הנדרשות ומתן ביטוי טרנסגני מתמשך לטיפול במחלת עיניים 3,4.
וקטורים ויראליים ולא ויראליים רבים זמינים לטיפול גנטי; עם זאת, וקטורים AAV הם בעלי עניין רב בשל פרופיל הבטיחות המצוין שלהם. AAV הוא נגיף דנ"א קטן, חד-גדילי, שאינו עטוף בו, שהתגלה לראשונה כמזהם של תכשיר אדנו-וירוס בשנת 1965 על ידי Atchison et al.5,6 AAV הונדס לאחר מכן כווקטור ויראלי יעיל להעברת גנים בשנות ה-80 והפך לווקטור הריפוי הגנטי המועדף על מחלות רבות, כולל הפרעות עיניים, בעשורים האחרונים. הבולטת שבהן היא התרופה המסחרית הראשונה לטיפול גנטי, voretigene neparvovec, שאושרה על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית לטיפול באמאורוזיס מולד של לבר, מחלת עיניים אחורית נדירה. למרות ש-voretigene neparvovec התגברה בהצלחה על מחסומים להתפתחות קלינית, נותרו אתגרים למסחור של טיפולים גנטיים נוספים בעיניים. לדוגמה, voretigene neparvovec ניתנת לחולים השומרים על תאי רשתית בני קיימא באמצעות הזרקה תת-רשתית. לפיכך, חולים עם צורות מתקדמות יותר של המחלה שאין להם תאי רשתית בני קיימא אינם זכאים לטיפול, מכיוון שהוא לא יספק שום תועלת קלינית. בנוסף, נצפו סיבוכים ידועים הקשורים להליך ההזרקה התת-רשתית, כולל דלקת עיניים, קטרקט, קריעת רשתית, מקולופתיה וכאבים 7,8. חששות אחרים הקשורים להליך זה כוללים את האפשרות של דימום, ניתוק הרשתית, אנדופתלמיטיס, ושלילת מצב חסוי של חיסון העין באמצעות הרס רקמת העין 9,10,11,12. לפיכך, המאמצים לחקור נתיבי העברת גנים פחות פולשניים כגון הזרקת SCJ הפכו חשובים יותר ויותר 13,14,15,16,17.
הלחמית היא קרום דק המכיל 3-5 שכבות של תאים ומחבר את העין הקדמית לעפעף הפנימי. זריקות SCJ משמשות קלינית להעברת תרופות עיניים הן למקטעים הקדמיים ו/או האחוריים של העין לטיפול במחלות עיניים כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, גלאוקומה, רטיניטיס ואובאיטיס אחורית18,19. הם פשוטים יחסית לביצוע, משמשים באופן שגרתי למתן תרופות עיניים במסגרת אשפוזיום 20, מעט ללא כאבים, אינם פוגעים בפריבילגיה החיסונית של העין, ומאפשרים לתרופות הניתנות להתפשט דרך אזור פריאורביטלי גדול המקיף את עצב הראייה. לפיכך, זריקות SCJ הן מסלול אטרקטיבי של מתן עבור יישומי טיפול גנטי AAV. סרוטיפים טבעיים של AAV הניתנים באמצעות הזרקת SCJ בעכברים אופיינו בעבר לבטיחות, יעילות התמרת, אימונוגניות בסרום, פיזור ביולוגי וספציפיות רקמות13,16,21. נתונים אלה הראו כי העברת גנים לרקמות עיניים בודדות באמצעות מתן SCJ היא אפשרות פורמלית.
מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן להתאמה להזרקת SCJ כדי לספק וקטורים של AAV במודל עכבר. כדי להבטיח את יכולת השכפול של גישה זו, מתוארת מערכת הזרקה המורכבת מסטריאומיקרוסקופ, משאבת מזרק עירוי/נסיגה הניתנת לתכנות (המאפשרת מהירות הזרקה ולחץ עקביים ומדויקים), ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת זו ניתנת להתאמה לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים כגון זריקות תוך-סטרומליות, תוך-עיניות, תוך-עיניות ותת-עיניות בבעלי חיים קטנים. בנוסף, לעתים קרובות משתמשים בצבע פלואורסצין כדי לאפשר הדמיה של אתר ההזרקה AAV. השלבים המעשיים המרכזיים במסלול הניהול, הגדרת פלטפורמת ההזרקה, הכנת ההזרקה וטיפים מניסיון ישיר יידונו בפירוט. לבסוף, טכניקות אימות נפוצות לאישור העברת AAV לרקמות הרצויות יידונו בקצרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

מחלות עיניים כוללות מגוון רחב של הפרעות גנטיות תורשתיות ונרכשות המהוות מטרות מושכות לאספקת תרופות מקומית בשל קלות הנגישות היחסית שלהן באמצעות נתיבי מתן מרובים. זריקות תת-קרקעיות (SCJ) מציעות יתרונות על פני נתיבי מתן תוך עיניים אחרים מכיוון שהן פשוטות, בטוחות ומבוצעות בדרך כלל במסגרת אשפוז יום. זריקות SCJ בבעלי חיים קטנים בדרך כלל דורשות סיוע של מיקרוסקופ ניתוחי בשל גודל העין. עבודות קודמות הראו כי הזרקת SCJ של סרוטיפים ספציפיים הקשורים לאדנו (AAV) היא אסטרטגיית העברת גנים תקפה להתמרה ממוקדת של משטח העין, שרירי העין, הקרנית ועצב הראייה, ומספקת גישה פוטנציאלית לטיפול במחלות עיניים רבות.
כאן מוצג פרוטוקול מפורט להזרקות SCJ במודל עכבר באמצעות מערכת הזרקה המורכבת ממשאבת מזרק עירוי/נסיגה הניתנת לתכנות (המאפשרת מהירות הזרקה ולחץ עקביים ומדויקים) ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת ההזרקה ניתנת להתאמה גם לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים כגון זריקות תוך-עיניות, תוך-רחמיות, תוך-עיניות וסוברטינליות בבעלי חיים קטנים. למרות שמתוארת אספקת וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו למחקרי ריפוי גנטי בעיניים, ניתן להתאים את הפרוטוקול כאן גם למגוון תמיסות עיניים במודלים של בעלי חיים קטנים. השלבים המעשיים המרכזיים במסלול הניהול, הגדרת פלטפורמת ההזרקה, הכנת ההזרקה וטיפים מניסיון ישיר יידונו בפירוט. בנוסף, טכניקות אימות נפוצות לאישור אספקת AAV לרקמות הרצויות יידונו גם הן בקצרה.

תמיסה המוזרקת לחלל תת-הלחמית מוצגת כ-bleb בהתאם לנפח ההזרקה. בניסוי זה, 7 μL של AAV (7 × 109 גנומים נגיפיים (vg)/עין) מעורבבים עם פלואורסצין בריכוז סופי של 0.1% הוזרק עם מחט 36 G תחת סטריאומיקרוסקופ, ומהירות ההזרקה / לחץ הוחזקה קבועה באמצעות משאבת מזרק ניתנת לתכנות ב 1 μL / s. bleb יכול להופיע ?...

Watch this Scientific Journal Video about Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models at JoVE.com

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

בכתב יד זה, הזרקה תת-קרקעית מודגמת כשיטת העברה וקטורית תקפה לרקמות עיניים בעכברים באמצעות מערכת הזרקה המורכבת ממשאבת מזרק אינפוזיה/נסיגה ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת הזרקה זו ניתנת להתאמה גם לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים.

מתן תת-לחמית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו במודלים של בעלי חיים קטנים

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

פרוטוקול זה מציע שיטה של העברת ריפוי גנטי לרקמות עיניים מרובות באופן בטוח, קל ויעיל. הוא גם ניתן להתאמה להזרקות אינטרסטרומליות וסוברטינליות בבעלי חיים קטנים. השימוש במסלול התת-קרקעי של ההזרקה הוא זעיר פולשני.הוא מהווה פחות סיכונים וטומן בחובו הבטחה גדולה לאספקת AV לטיפול במחלות עיניים מרובות. עם למעלה ממיליארד אנשים ברחבי העולם הסובלים מליקוי ראייה, שימוש בשיטה בטוחה וקלה לאספקת תרופות מציע ישימות רחבה לטיפול בגורמים רבים ושונים לעיוורון. שיטות העברת הגנים המתוארות בפרוטוקול זה מעניינות במיוחד את אלה המפתחים אסטרטגיות התערבות פוטנציאליות ומתרגלים רופאי עיניים, שבסופו של דבר יספקו תרופות אלה לחולים.האתגר הגדול ביותר עבור מי שמבצע פרוטוקול זה בפעם הראשונה הוא ככל הנראה החדרת המחט לחלל הלחמית המושגי. כדי להתחיל, להרכיב את מערכת ההזרקה על ידי הצבת מיקרוסקופ סטריאו ומשאבת מזרק בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, לחתוך את צינורות פוליאתילן לאורך של כ 50 ס"מ.הכנס את קצה המחט בעלת 36 המדים לקצה אחד של הצינור. לאחר מכן למלא מזרק חד פעמי 3 מיליליטר עם מים סטריליים ולהכניס אותו לתוך הצד של הצינור מול המחט. שטפו את הצינורות שלוש פעמים, לסירוגין בין מים סטריליים ל-70% אלכוהול כדי לחטא את הצינורות ולוודא שאין נזילות, סתימות או נזקים לאורך כל הצינורות.באמצעות מזרק חד פעמי של 3 מיליליטר, ממלאים את הצינורות במים סטריליים ומשאירים את הצינורות מחוברים למזרק החד פעמי. לאחר מכן מניחים חתיכת parafoam על פני השטח של ארון בטיחות ביו, ולהוסיף בריכה של מים סטריליים אליו. טבלו את חלק הצינורות המחוברים למחט בבריכת המים הסטריליים.לאחר מכן, משוך את המזרק החד פעמי מפתח הצינור כדי למנוע כניסת אוויר למערכת הצינורות עם הסרת המזרק. ואז למלא מזרק המילטון 10 מיקרוליטר עם מים סטריליים. לאחר מכן, חבר את מחט מזרק המילטון לקצה הפתוח של הצינורות על ידי טבילת קצה המחט של מזרק המילטון לתוך בריכת המים הסטריליים על סרט הפרה.לחצו לחיצה ממושכת על כפתור ההיפוך המהיר במסך המשאבה כדי להזיז את גושי הדחיפה לאורך המשוער של המזרק. לאחר מכן, פתח את ידיות הידוק של התושבת כדי לשחרר את הסוגריים התומכים על הדוחף ואת בלוקים מחזיק המזרק. לאחר מכן, טען את מזרק המילטון על בלוק מחזיק המזרק ואבטח את המזרק בהתאם להוראות היצרן.כדי להתאים את הפרמטרים במסך הגדרת המשאבה, לחץ על הלחצן Force"button והגדר את רמת הכוח ב- 30% לאחר מכן קבל את השינויים כדי לחזור למסך ההגדרות. לחץ על לחצן התחלה מהירה", בחר שיטה ולאחר מכן בחר באפשרות החדל בלבד". עבור אפשרות המזרק, בחר המילטון 1700, ולאחר מכן לחץ על זכוכית "ובחר 10 מיקרוליטר.מאוחר יותר, בחר את קצב העירוי ואת נפח ההזרקה. הוציאו את המים ממזרק המילטון תוך השארת מחט הצינורות וההזרקה מלאים במים על ידי לחיצה על כפתור ההחדרה. לאחר מכן, למשוך את הנגיף על ידי הצבת מחט ההזרקה לתוך aliquot של מלאי הנגיף.לאחר מכן משוך מעט בחזרה את מזרק המילטון על ידי לחיצה על הכפתור האחורי כדי להציג בועת אוויר קטנה בצינור. לאחר הרדמת החיה, לתפוס את הלחמית עם מלקחיים. לאחר מכן הכנס את המחט לתוך הלחמית עד שהשיקוע מכוסה כולו על ידי קרום הלחמית, והנח את המחט על הגלובוס.במקביל, התחל את ההזרקה על ידי לחיצה על כפתור התחל באמצעות מתג כף הרגל. כדי לבחון את התפלגות וקטור ה-AAV, העינית והרקמות הסובבות אותה הוכתמו בהמטוקסילין ובאוזין. המקטעים הסגיטליים המייצגים הראו כי פיזור הדיו ההודי התרחש בעיקר בצמוד לשרירים החוץ-עיניים בפני השטח החיצוניים של הסקלרה ברקמות החיבור הרופפות הפריוקולריות.כדי לאשר התמרה של AAV 8 משלים עצמי בשמונה שבועות לאחר ההזרקה, נבדק שפע חלבון פלואורסצנטי ירוק בחתכים על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה. התוצאות גילו כי וקטורים AAV 8 מתמרים ביעילות את השרירים הפריוקולריים האחוריים לעין ולקרנית. כדי לנתח את ההתפלגות הביולוגית הווקטורית, מספרי העתקי גנום וקטורי ותאי עין מובחנים באיברים אחרים, כולל כבד ולב, נבדקו על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית באמצעות פריימרים וגששים ספציפיים לטרנסגן.הביטוי של הטרנסגן אושר על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך, מה שהציע כי הזרקה תת-קרקעית של AAV 8 גורמת לביטוי טרנסגני בעפעף, בלחמית, בקרנית ובעצב הראייה. בועת האוויר תשמש כמחסום בין המים בצינור לבין התרופה הטיפולית. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים אחרים לחקור את השימוש במסלול התת-לחמיתי של מתן הן לתמיסות עיניים והן לטיפולים גנטיים בעיניים למחלות מרובות.

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

פרוטוקול ליפרתרמיה הארוכה משך כל גוף בעכברים

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

מערכת העבודה לב מבודדת למודלים בבעלי חיים גדולים

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

אין ויוו הערכה של שבר פיתוח קסם במהלך עצם הריפוי בעכברים שימוש בהתקן התואם ל- MRI Osteosynthesis את העכבר אתי

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

דגימת דם רציפה בפליטת פוזיטרון של בעלי חיים קטנים טומוגרפיה ממוחשבת/טומוגרפיה ממוחשבת מאפשרת את המדידה של פונקציית הקלט העורקי

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...