Name: subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00
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Gli autori ringraziano il Vector Core dell'Università della Carolina del Nord per aver fornito i vettori scAAV8-GFP utilizzati in questo studio, il CGIBD Histology Core e il laboratorio del Dr. Brian C. Gilger per la loro assistenza con gli aspetti di valutazione clinica di questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship e da un Career Development Award dell'American Society of Gene & Cell Therapy e della Cystic Fibrosis Foundation. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale dell'American Society of Gene & Cell Therapy o della Cystic Fibrosis Foundation.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con i regolamenti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. L'uso di vettori AAV è un rischio di biosicurezza di livello 1. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, tra cui un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi quando si maneggia AAV. Per l'esperimento qui descritto, è stato utilizzato un vettore AAV ricombinante confezionato con il capside ...

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	<li>Bourne, R. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnitude,+temporal+trends,+and+projections+of+the+global+prevalence+of+blindness+and+distance+and+near+vision+impairment:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).</li><li>Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+polymeric+nanoparticles+in+the+eye:+implications+in+ocular+disease+therapy.">Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).</li><li>Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+therapy+for+diseases+of+the+eye.">Advances in gene therapy for diseases of the eye.</a> Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomised,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+adenovirus-associated+virus+(AAV)+in+cell+cultures.">Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures.</a> Virology. 29 (2), 353-357 (1966).</li><li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection:+a+review+on+the+novel+route+of+therapeutic+delivery+for+vitreoretinal+diseases.">Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases.</a> Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).</li><li>Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. 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C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subconjunctival+injection+of+recombinant+AAV-angiostatin+ameliorates+alkali+burn+induced+corneal+angiogenesis.">Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis.</a> Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).</li><li>Veneziale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCH+412499:+biodistribution+and+safety+of+an+adenovirus+containing+P21(WAF-1/CIP-1)+following+subconjunctival+injection+in+Cynomolgus+monkeys.">SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).</li><li>Liu, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+subconjunctival+injection+of+adenovirus+in+rats:+a+study+of+local+distribution,+transgene+duration+and+safety.">Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety.</a> PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).</li><li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV8-mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy.</a> Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+administration+of+adeno-associated+virus+vectors+for+corneal+gene+delivery.">Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).</li><li>de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intravitreal+injections+on+intraocular+pressure+and+retinal+nerve+fiber+layer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).</li><li>Hartman, R. R., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal,+subretinal,+and+suprachoroidal+injections:+evolution+of+microneedles+for+drug+delivery.">Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).</li><li>Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+spikes+due+to+intravitreal+bevacizumab+injections+by+scleral+indentation+with+cotton+swab+or+digital+ocular+massage:+innovative+techniques+compared.">Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared.</a> Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).</li><li>Crabtree, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+expression+of+HLA-G1/5+reduces+severity+of+experimental+autoimmune+uveitis.">AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+limbal+stem+cells+using+viral+vectors.">Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).</li><li>Reichel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+conjunctival+scarring+in+the+mouse+eye.">New model of conjunctival scarring in the mouse eye.</a> British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).</li><li>Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+shedding+and+immunogenicity+sampling+for+retinal+gene+therapy.">Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy.</a> Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).</li><li>Gilger, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fixed-depth+microneedle+enhances+reproducibility+and+safety+for+corneal+gene+therapy.">A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy.</a> Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).</li><li>Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+and+porcine+transscleral+solute+transport:+influence+of+lipophilicity+and+the+Choroid-Bruch's+layer.">Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).</li></ol>

La terapia genica mediata da AAV ha un grande potenziale per il trattamento delle malattie oculari. L'attuale terapia genica oculare si basa su due principali vie di somministrazione locale, iniezioni intravitreali e sottoretiniche. Sfortunatamente, entrambe le vie sono invasive e possono causare gravi complicazioni, tra cui il distacco della retina, la formazione di cataratta e l'endoftalmite. Pertanto, lo studio di vie relativamente meno invasive, come l'iniezione di SCJ, è di grande interesse.
<p class="jove_cont...

Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie sia genetiche che acquisite. Nel 2015, circa 36 milioni di persone erano legalmente cieche in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone soffre di almeno un certo livello di disabilità visiva, evidenziando la necessità di aumentare gli sforzi di alleviamento a tutti i livelli1. I principali metodi per la somministrazione di farmaci oculari includono sia la somministrazione topica che locale, come colliri o iniezioni subcongiuntivali (SCJ), intracamerali, intravitreali e sottoretiniche. Sebbene la terapia topica non invasiva sia il metodo di somministrazione più comune per i farmaci oftalmici e sia ampiamente utilizzata per molti disturbi del segmento anteriore, la presenza di barriere anatomiche corneali presenta una sfida per la biodisponibilità, la biodistribuzione e l'efficacia delle sostanze somministrate localmente, suggerendo che potrebbe non essere la migliore via di trattamento candidata per molte malattie dell'occhio interno. L'iniezione locale nello specifico compartimento oculare interessato dalla malattia è probabilmente un approccio di somministrazione del farmaco più efficace e mirato2. Tuttavia, gli effetti avversi derivanti da iniezioni ripetute possono complicare le strategie di somministrazione. Idealmente, una terapia dovrebbe mantenere l'efficacia terapeutica a lungo termine dopo una singola somministrazione. Pertanto, la terapia genica è un'opzione promettente per ridurre al minimo il numero di iniezioni necessarie e fornire un'espressione transgenica sostenuta per il trattamento della malattia oculare 3,4.
Numerosi vettori virali e non virali sono disponibili per la terapia genica; tuttavia, i vettori AAV sono di grande interesse a causa del loro eccellente profilo di sicurezza. AAV è un piccolo virus a DNA a singolo filamento e senza involucro che è stato inizialmente scoperto come contaminante di una preparazione di adenovirus nel 1965 da Atchison et al.5,6 AAV è stato successivamente progettato come un vettore virale efficiente per la consegna genica nel 1980 ed è diventato il vettore di terapia genica di scelta per molte malattie, compresi i disturbi oculari, negli ultimi decenni. Il più notevole di questi è il primo farmaco di terapia genica disponibile in commercio, voretigene neparvovec, che è stato approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti per trattare l'amaurosi congenita di Leber, una rara malattia dell'occhio posteriore. Sebbene voretigene neparvovec abbia superato con successo le barriere allo sviluppo clinico, permangono sfide per la commercializzazione di ulteriori terapie geniche oculari. Ad esempio, voretigene neparvovec viene somministrato a pazienti che conservano cellule retiniche vitali tramite iniezione sottoretinica. Pertanto, i pazienti con forme più avanzate della malattia che mancano di cellule retiniche vitali non sono eleggibili per il trattamento, in quanto non fornirebbe alcun beneficio clinico. Inoltre, sono state osservate complicanze note associate alla procedura di iniezione sottoretinica, tra cui infiammazione oculare, cataratta, lacrimazione della retina, maculopatia e dolore 7,8. Altre preoccupazioni relative a questa procedura includono la possibilità di emorragia, distacco di retina, endoftalmite e revoca dello stato di privilegiato immunitario oculare attraverso la distruzione del tessuto oculare 9,10,11,12. Pertanto, gli sforzi per esplorare vie di consegna genica meno invasive come l'iniezione di SCJ sono diventati sempre più importanti 13,14,15,16,17.
La congiuntiva è una sottile membrana contenente 3-5 strati di cellule e che collega l'occhio anteriore alla palpebra interna. Le iniezioni di SCJ sono utilizzate clinicamente per la somministrazione di farmaci oftalmici sia ai segmenti anteriore che / o posteriore dell'occhio per il trattamento di malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, il glaucoma, la retinite e l'uveite posteriore18,19. Sono relativamente semplici da eseguire, impiegati di routine per la somministrazione di farmaci oftalmici in un ambiente ambulatoriale20, in qualche modo indolori, non compromettono il privilegio immunitario oculare e consentono ai farmaci somministrati di diffondersi attraverso un'ampia regione periorbitale che comprende il nervo ottico. Pertanto, le iniezioni di SCJ sono una via di somministrazione interessante per le applicazioni di terapia genica AAV. I sierotipi naturali AAV somministrati tramite iniezione di SCJ nei topi sono stati precedentemente caratterizzati per sicurezza, efficienza di trasduzione, immunogenicità sierica, biodistribuzione e specificità tissutale13,16,21. Questi dati hanno dimostrato che la consegna genica ai singoli tessuti oculari attraverso la somministrazione di SCJ è una possibilità formale.
Questo articolo descrive un protocollo semplice e adattabile per l'iniezione di SCJ per fornire vettori AAV in un modello murino. Per garantire la riproducibilità di questo approccio, viene descritto un sistema di iniezione costituito da uno stereomicroscopio, una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema è adattabile per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Inoltre, un colorante fluoresceina viene spesso utilizzato per consentire la visualizzazione del sito di iniezione AAV. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell'iniezione e i suggerimenti dall'esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Infine, verranno brevemente discusse le tecniche di validazione comuni per la conferma della somministrazione di AAV ai tessuti desiderati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>36 G NanoFil Needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV vector</td>
			<td>&#160; University of North Carolina at Chapel Hill</td>
			<td>&#160; /</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0079-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>AVES labs Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Cannon</td>
			<td>Cannon EOS T5i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7654-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India ink</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>NC9903975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture-resistant film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>807-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine 0.1%</td>
			<td>Bausch Health US</td>
			<td>NDC 24208-730-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rebound tonometer</td>
			<td>Tonovet</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein solution</td>
			<td>Sigma-Aldich</td>
			<td>46960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopye</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Mz6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>Rx only</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topical ointment</td>
			<td>GenTeal</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads</td>
			<td>ZONE-QUICK</td>
			<td>PO6448</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models

Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie genetiche ereditarie e acquisite che sono obiettivi interessanti per la somministrazione locale di farmaci a causa della loro relativa facilità di accessibilità attraverso più vie di somministrazione. Le iniezioni subcongiuntivali (SCJ) offrono vantaggi rispetto ad altre vie di somministrazione intraoculare in quanto sono semplici, sicure e di solito eseguite in un ambiente ambulatoriale. Le iniezioni di SCJ in piccoli animali di solito richiedono l'assistenza di un microscopio operatorio a causa delle dimensioni dell'occhio. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'iniezione SCJ di specifici sierotipi di virus adeno-associati (AAV) è una valida strategia di consegna genica per la trasduzione mirata della superficie oculare, del muscolo oculare, della cornea e del nervo ottico, fornendo un potenziale approccio per il trattamento di molte malattie oculari.
Qui viene presentato un protocollo dettagliato per le iniezioni di SCJ in un modello murino utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi per microiniezione. Il sistema di iniezione è adattabile anche per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Sebbene sia descritto il rilascio di vettori virali adeno-associati per studi di terapia genica oculare, il protocollo qui contenuto può anche essere adattato per una varietà di soluzioni oftalmiche in piccoli modelli animali. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell'iniezione e i suggerimenti dall'esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Inoltre, saranno brevemente discusse anche le tecniche di convalida comuni per la conferma della consegna di AAV ai tessuti desiderati.

La soluzione iniettata nello spazio subcongiuntivale si presenta come un bleb a seconda del volume di iniezione. In questo esperimento, 7 μL di AAV (7 × 109 genomi virali (vg)/occhio) miscelati con fluoresceina ad una concentrazione finale dello 0,1% sono stati iniettati con un ago da 36 G sotto uno stereomicroscopio e la velocità/pressione di iniezione è stata mantenuta costante utilizzando una pompa a siringa programmabile a 1 μL/s. Un bleb può apparire all'iniezione (freccia). Una ...

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Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Questo protocollo offre un metodo di somministrazione della terapia genica a più tessuti oculari in modo sicuro, facile ed efficace. È anche adattabile per iniezioni intrastromali e sottoretiniche in piccoli animali. L'uso della via di iniezione subcongiuntivale è minimamente invasivo.Pone meno rischi e rappresenta una grande promessa per la somministrazione AV per il trattamento di più malattie oculari. Con oltre 1 miliardo di persone in tutto il mondo che soffrono di disabilità visive, l'utilizzo di un metodo sicuro e semplice per la somministrazione di farmaci offre un'ampia applicabilità per il trattamento di molte diverse cause di cecità. I metodi di consegna genica descritti in questo protocollo sono di particolare interesse per coloro che stanno sviluppando potenziali strategie di intervento e praticando oftalmologi, che alla fine consegneranno questi farmaci ai pazienti.La sfida più grande per qualcuno che sta eseguendo questo protocollo per la prima volta è probabilmente l'inserimento dell'ago nello spazio congiuntivale concettuale. Per iniziare, assemblare il sistema di iniezione posizionando uno stereomicroscopio e una pompa a siringa in un armadio di biosicurezza. Quindi, tagliare il tubo di polietilene ad una lunghezza di circa 50 centimetri.Inserire l'estremità di un ago calibro 36 in un'estremità del tubo. Quindi riempire una siringa monouso da 3 millilitri con acqua sterile e inserirla nel lato del tubo opposto all'ago. Lavare il tubo tre volte, alternando acqua sterile e alcool al 70% per disinfettare il tubo e assicurarsi che non vi siano perdite, intasamenti o danni in tutto il tubo.Utilizzando la siringa monouso da 3 millilitri, riempire il tubo con acqua sterile e lasciare il tubo attaccato alla siringa monouso. Quindi posizionare un pezzo di paraschiuma sulla superficie dell'armadio di bio-sicurezza e aggiungere una pozza di acqua sterile ad esso. Immergere la porzione del tubo collegato all'ago nella piscina di acqua sterile.Quindi, estrarre la siringa monouso dall'apertura del tubo per evitare che l'aria entri nel sistema di tubi dopo la rimozione della siringa. Quindi riempire una siringa Hamilton da 10 microlitri con acqua sterile. Quindi, collegare l'ago della siringa di Hamilton all'estremità aperta del tubo immergendo la punta dell'ago della siringa di Hamilton nella pozza di acqua sterile sul film parapara.Tenere premuto il pulsante di inversione rapida sullo schermo della pompa per spostare i blocchi di spinta alla lunghezza approssimativa della siringa. Quindi, svitare le manopole di serraggio della staffa per allentare le staffe di fissaggio sullo spintore e sui blocchi del supporto della siringa. Successivamente, caricare la siringa Hamilton sul blocco portasiringa e fissare la siringa seguendo le istruzioni del produttore.Per regolare i parametri nella schermata di impostazione della pompa, premere il pulsante "Forza" e impostare il livello di forza su 30%Quindi accettare le modifiche per tornare alla schermata di impostazione. Premere il pulsante "Quick Start", selezionare Metodo, quindi selezionare l'opzione "Solo infusione". Per l'opzione siringa, selezionare Hamilton 1700, quindi fare clic su "Vetro" e selezionare 10 microlitri.Successivamente, selezionare la velocità di infusione e il volume di iniezione. Espellere l'acqua dalla siringa di Hamilton lasciando il tubo e l'ago per iniezione pieni d'acqua premendo il pulsante "Infuse". Quindi, prelevare il virus inserendo l'ago per iniezione in un'aliquota dello stock virale.Quindi tirare leggermente indietro la siringa di Hamilton premendo il pulsante inverso per introdurre una piccola bolla d'aria nel tubo. Dopo aver anestetizzato l'animale, afferra la congiuntiva con una pinza. Quindi inserire l'ago nella congiuntiva fino a quando la smussatura è interamente coperta dalla membrana congiuntivale e appoggiare l'ago contro il globo.Contemporaneamente, iniziare l'iniezione premendo il pulsante "Start" utilizzando l'interruttore a pedale. Per esaminare la distribuzione del vettore AAV, i tessuti oculari e circostanti sono stati colorati con ematossilina ed eosina. Le sezioni sagittali rappresentative hanno dimostrato che la dispersione dell'inchiostro indiano si è verificata principalmente adiacente ai muscoli extraoculari nella superficie esterna della sclera nei tessuti connettivi sciolti perioculari.Per confermare la trasduzione dell'AAV 8 auto-complementare a otto settimane dopo l'iniezione, l'abbondanza di proteine a fluorescenza verde nelle sezioni trasversali è stata esaminata mediante colorazione con immunofluorescenza. I risultati hanno rivelato che i vettori AAV 8 trasducevano efficacemente i muscoli perioculari posteriori all'occhio e alla cornea. Per analizzare la biodistribuzione del vettore, i numeri di copie del genoma vettoriale e i compartimenti oculari distinti in altri organi, tra cui fegato e cuore, sono stati esaminati mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa utilizzando primer e sonde specifici per il transgene.L'espressione del transgene è stata confermata dalla reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa, che ha suggerito che l'iniezione subcongiuntivale di AAV 8 provoca l'espressione di transgeni nella palpebra, nella congiuntiva, nella cornea e nel nervo ottico. La bolla d'aria fungerà da barriera tra l'acqua nel tubo e il farmaco terapeutico. Questa tecnica consente ad altri ricercatori di esplorare l'uso della via di somministrazione subcongiuntivale sia per le soluzioni oftalmiche che per le terapie geniche oculari per più malattie.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Ricerca

Medicina

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